李丹 李成 孫璐 鄒丹 劉志文 叢麗娜

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034）

海參溶菌酶基因在枯草芽孢桿菌WB600中的整合及表達(dá)

李丹 李成 孫璐 鄒丹 劉志文 叢麗娜

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034）

采用枯草芽孢桿菌WB600（Bacillus subtilis WB600）在體外表達(dá)海刺參溶菌酶（Stichopus japonicus lysozyme，SjLys）蛋白。通過(guò)構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-P43-SjLys，將B. subtilis自身強(qiáng)啟動(dòng)子P43序列和已分離得到的SjLys基因（GenBank登錄號(hào)EF036468）連接（P43-SjLys）。經(jīng)BamH I/EcoR I酶切，將P43-SjLys片段連接到B. subtilis整合載體pDG1730上，構(gòu)建整合重組質(zhì)粒pDG-P43-SjLys。經(jīng)Xho I酶切處理，線性化的pDG-P43-SjLys質(zhì)粒轉(zhuǎn)化B. subtilis WB600細(xì)胞。P43-SjLys片段通過(guò)同源雙交換重組整合到B. subtilis WB600染色體上，成功得到具有穩(wěn)定遺傳的基因工程菌B. subtilis WB600/P43-SjLys。經(jīng)SDS-PAGE和抑菌試驗(yàn)分析表明，培養(yǎng)60 h后，B. subtilis WB600/P43-SjLys能夠表達(dá)可溶的，對(duì)常見(jiàn)的海洋細(xì)菌溶壁微球菌和金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性的SjLys蛋白。首次在B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)中得到可溶且具有酶活功能的SjLys蛋白，為SjLys的生產(chǎn)提出了一種具有可行性的和潛力的新方法。

海參溶菌酶 枯草芽孢桿菌 啟動(dòng)子P43 同源重組 整合表達(dá)

在我國(guó)沿海地區(qū)，由于具有重要的醫(yī)用、食用價(jià)值，海參人工養(yǎng)殖已發(fā)展成一項(xiàng)前景廣闊的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)。但近幾年，隨著養(yǎng)殖密度的增大，常見(jiàn)的病害嚴(yán)重制約了海參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，同時(shí)，抗生素類藥物的大量使用增加殘留，也引起了相應(yīng)的食品安全問(wèn)題。隨著深入地研究發(fā)現(xiàn)，海參溶菌酶（Stichopus japonicuslysozyme，SjLys）作為一種具有糖苷酶活性和廣譜、非酶抑菌活性的i型溶菌酶，是海參機(jī)體先天免疫系統(tǒng)中的重要防御因子，具有廣泛的抗菌譜。在人工養(yǎng)殖中，海參溶菌酶作為抗生素重

要的替代品，對(duì)通常引起水產(chǎn)動(dòng)物嚴(yán)重病害的病原菌弧菌和假單胞菌具有明顯的抗菌效果，也能有效解決抗生素殘留問(wèn)題，在綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外研究人員的高度重視［1-5］。

采用大腸桿菌系統(tǒng)成功表達(dá)SjLys蛋白已有報(bào)道［5-7］。但是，其中存在一些不可忽視的問(wèn)題。一方面，因?yàn)閱为?dú)表達(dá)的全長(zhǎng)SjLys蛋白主要以包涵體狀態(tài)存在，所以目前原核E. coli系統(tǒng)得到的可溶的，具有抑菌活性的SjLys蛋白及其部分截?cái)嗥沃饕匀诤系鞍譚rx-His-SjLys形式存在［6，7］，這不利于后續(xù)蛋白理化性質(zhì)的深入研究。另一方面，宿主E. coli會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素、細(xì)胞毒素和腸毒素等對(duì)人體有害的物質(zhì)；同時(shí)，為了保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，重組E. coli培養(yǎng)過(guò)程中需要使用抗生素，增加抗生素類物質(zhì)的殘留，這些都存在食品安全問(wèn)題。

作為食品安全級(jí)別的原核表達(dá)宿主，枯草芽孢桿菌（B. subtilis）具有表達(dá)可溶的、非融合蛋白的能力。B. subtilis也具備E. coli沒(méi)有的一些優(yōu)良特性，如不產(chǎn)內(nèi)毒素和致熱敏蛋白質(zhì)，非致病性，且沒(méi)有明顯的密碼子偏好性［8，9］。迄今為止，在枯草芽孢桿菌及其近緣種中已經(jīng)克隆和表達(dá)了大量的原核和真核基因，其中有的已應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)［10，11］。

本試驗(yàn)將選取B. subtilisWB600作為SjLys內(nèi)源表達(dá)宿主。通過(guò)構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-P43-SjLys，利用基因工程手段，構(gòu)建帶有強(qiáng)啟動(dòng)子P43的整合載體pDG-P43-SjLys。載體線性化后，轉(zhuǎn)化到已敲除6種蛋白酶基因的B. subtilisWB600中，通過(guò)同源雙交換重組將SjLys表達(dá)元件整合進(jìn)枯草芽孢桿菌基因組染色體中，并對(duì)海參溶菌酶在宿主B. subtilisWB600/P43-SjLys中的表達(dá)進(jìn)行初步研究，旨在為SjLys的生產(chǎn)提出一種具有可行性和潛力的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 試驗(yàn)涉及的菌株、質(zhì)粒及其相關(guān)性質(zhì)、來(lái)源詳見(jiàn)表1。

表 1 供試菌株和質(zhì)粒

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 限制性核酸內(nèi)切酶，TaqDNA聚合酶和DNA ladder marker購(gòu)自TaKaRa（大連）公司；質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京艾來(lái)德生物科技有限公司；引物為華大基因科技股份有限公司（北京）合成；其它常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基組分：10 g/L NaCl，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉。固體LB培養(yǎng)基添加1.5%（W/V）瓊脂粉。大腸桿菌轉(zhuǎn)化子篩選采用100 μg/mL氨芐青霉素（Ampr）抗性，枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子篩選采用100 μg/mL壯觀霉素（Spcr）抗性，枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備參照文獻(xiàn)［12］。

1.2 方法

DNA的純化和濃縮、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、DNA片段的酶切和連接等操作均參考相應(yīng)產(chǎn)品/試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.1 啟動(dòng)子P43基因序列的擴(kuò)增 參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明提取B. subtilis168基因組DNA。以B. subtilis強(qiáng)啟動(dòng)子P43基因序列為模板，設(shè)計(jì)上、下游引物，P43-1：5'-GATTCTTCGGATCCTTCGTGCATGCA-3'（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)）

和P43-2：5'-TTCCTCCCATGGCTATAATGGTACCGC-3'（下劃線為NcoI酶切位點(diǎn)）。

用TaqDNA聚合酶PCR擴(kuò)增P43序列，PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃40 s，30循環(huán)；72℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 重組質(zhì)粒pMD18-P43、pMD18-P43-SjLys和pDG-P43-SjLys的構(gòu)建 將“1.2.1”中用Taq酶擴(kuò)增的3'末端帶突出堿基“核苷酸A”的PCR產(chǎn)物（啟動(dòng)子P43）與線性載體pMD18-T進(jìn)行TA連接。在16℃條件下，過(guò)夜連接，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD18-P43。

重組質(zhì)粒pMD18-P43和pMD18-SjLys（實(shí)驗(yàn)室保存）分別用BamH I/NcoI雙酶切3 h。凝膠電泳鑒定后，純化、回收目的片段。在16℃條件下，將上述酶切回收的P43啟動(dòng)子片段和線性載體pMD18-SjLys過(guò)夜連接，構(gòu)建克隆載體pMD18-P43-SjLys。

質(zhì)粒pMD18-P43-SjLys和整合載體pDG1730用BamH I/EcoR I雙酶切3 h。凝膠電泳鑒定后，回收目的片段。在16℃條件下，將P43-SjLys片段和線性整合載體pDG1730過(guò)夜連接，構(gòu)建枯草芽孢桿菌的整合載體pDG-P43-SjLys。

1.2.3 質(zhì)粒與B. subtilisWB600的整合B. subtilisWB600感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化方法參考文獻(xiàn)［12］。經(jīng)XhoI線性化處理后，重組質(zhì)粒pDGP43-SjLys電轉(zhuǎn)化至WB600感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽(yáng)性同源重組細(xì)胞B. subtilisWB600/P43-SjLys。

1.2.4 SjLys蛋白在B. subtilisWB600中的表達(dá) 菌體B. subtilisWB600/P43-SjLys細(xì)胞，過(guò)夜活化后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基，200 r/min，37℃培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間取50 mL發(fā)酵液，離心收集菌體。培養(yǎng)不同時(shí)間的菌體經(jīng)凍融處理后，超聲破碎（功率：150 W；破碎/間隔：5 s/5 s；15 min）。低溫離心（4℃，12 000 r/min，30 min），收集上清液，棄沉淀。

用60%的（NH4）2SO4處理上清液，低溫高速離心，收集沉淀。沉淀樣品用1×PBS（pH7.4）溶解，再于7 kD的透析袋中透析除鹽。15%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)SjLys蛋白在B. subtilisWB600中的表達(dá)情況。銀染顯色檢測(cè)SDS-PAGE中的蛋白條帶［13］。試驗(yàn)選取B. subtilisWB600空宿主進(jìn)行上述處理，作為陰性對(duì)照。

1.2.5 SjLys蛋白抑菌活性的檢測(cè) 抑菌試驗(yàn)與之前的研究方法類似［6，7］，用濾紙片法測(cè)定抑菌圈大小。試驗(yàn)以溶壁微球菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌。取50 μL的指示菌液（OD600≈ 0.05），均勻涂抹在LB固體培養(yǎng)基上，再放入滅菌的濾紙片。將“1.2.4”中培養(yǎng)了60 h的，經(jīng)過(guò)處理的樣品，取20 μL加到滅菌的濾紙片上，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈；以空宿主細(xì)胞破碎、離心后的上清液作為陰性對(duì)照。做3組平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選

2.1.1 重組質(zhì)粒pMD18-P43的構(gòu)建及篩選鑒定 根據(jù)圖 1-A的試驗(yàn)方案，構(gòu)建含B. subtilis自身強(qiáng)啟動(dòng)子P43序列的克隆載體pMD18-P43。啟動(dòng)子P43是B. subtilis的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，含有約430 bp的核苷酸（圖 1-B）。

PCR反應(yīng)以B. subtilis168基因組總DNA為模板，P43-1/P43-2為引物，在Taq酶作用下，擴(kuò)增啟動(dòng)子P43片段。經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳（圖 1-C，lane 2）分析顯示，在約430 bp處有一特異擴(kuò)增條帶，與預(yù)計(jì)的啟動(dòng)子P43片段大小相符，這表明PCR擴(kuò)增成功。將3'端帶有核苷酸“A”的P43擴(kuò)增片段與線性化T載體pMD18進(jìn)行TA連接，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-P43（圖 1-A）。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒用BamH I/NcoI酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定檢測(cè)。如果是重組質(zhì)粒pMD-P43，酶切后應(yīng)得到大小兩條帶，2 692 bp附近的pMD18空載體和430 bp左右的啟動(dòng)子P43；反之，如果是空質(zhì)粒pMD18，則只能得到一條帶。電泳結(jié)果（圖 1-C，lane 3）顯示，質(zhì)粒酶切后得到2條帶，分別處在400-500 bp和2-3 kb之間，與理論大小一致，表明試驗(yàn)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-P43。

2.1.2 重組質(zhì)粒pMD18-P43-SjLys的構(gòu)建及篩選鑒定 根據(jù)試驗(yàn)方案圖 2-A，將B. subtilis啟動(dòng)子P43連接至克隆載體pMD18-SjLys中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-P43-SjLys。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選挑取轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌落PCR。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在450 bp左右擴(kuò)增得到一

條帶，與P43大小一致（圖 2-B，lane 2）。單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用BamH I/NcoI酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳（圖 2-B，lane 3）顯示，質(zhì)粒酶切后得到兩條帶，分別約為400 bp和3.0 kb，分別與啟動(dòng)子P43和質(zhì)粒載體pMD-SjLys大小一致，表明質(zhì)粒pMD18-P43-SjLys重組成功。

圖1 重組質(zhì)粒pMD18-P43（A），P43 啟動(dòng)子核酸序列（B）和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（C）

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-P43-SjLys的構(gòu)建（A）和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（B）

2.1.3 整合載體pDG-P43-SjLys的構(gòu)建及篩選 根據(jù)試驗(yàn)方案圖 3-A，經(jīng)BamH I/EcoR I酶切后，將目的片段P43-SjLys插入pDG1730，構(gòu)建重組整合質(zhì)粒pDG-P43-SjLys。轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)壯觀霉素（Spc）抗性（100 μg/mL）篩選轉(zhuǎn)化子。菌落PCR的產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠電泳分析顯示，在

450 bp左右得到一條擴(kuò)增帶，與P43大小一致（圖3-B，lane 2）。提取質(zhì)粒，經(jīng)BamH I/EcoR I酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳顯示，質(zhì)粒酶切后得到兩條帶，分別為400 bp及8.0 kb左右（圖 3-B，lane 3），分別與啟動(dòng)子P43和整合空載體pDG1730大小一致，這表明質(zhì)粒pDG-P43-SjLys重組成功。

圖3 重組質(zhì)粒pDG-P43-SjLys的構(gòu)建（A）和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（B）

2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及篩選

經(jīng)XhoI酶切線性化處理后，重組整合質(zhì)粒pDG-P43-SjLys電轉(zhuǎn)化至B. subtilisWB600。P43-Sj-Lys處于pDG1730上與B. subtilisα-淀粉酶基因同源的兩段序列amyE’和’amyE之間，并與Spc基因相連（圖 4-A）。整合質(zhì)粒pDG-P43-SjLys通過(guò)同源重組可將P43-SjLys和Spc基因整合到B. subtilis基因組中的α-淀粉酶位點(diǎn)上（圖 4-A）。試驗(yàn)通過(guò)Spc抗性平板初篩轉(zhuǎn)化子。

圖 4 重組質(zhì)粒pDG-P43-SjLys線性化后與基因組發(fā)生同源重組（A）和淀粉水解圈檢測(cè)（B）

因?yàn)檎腺|(zhì)粒以同源雙交換方式整合，α-淀粉酶基因被敲除（圖 4-A）。利用這一性質(zhì)也可以將同源雙交換的重組菌挑選出來(lái)。將具有Spc抗性的陽(yáng)性菌株與未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的空白對(duì)照菌株分別點(diǎn)在含0.2%（W/V）淀粉的固體平板上，通過(guò)革蘭氏碘液顯色法觀察對(duì)比平板上的淀粉水解圈。試驗(yàn)結(jié)果（圖4-B）顯示，沒(méi)有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對(duì)照菌株1出現(xiàn)了明顯的淀粉水解圈，而轉(zhuǎn)化了線性整合載體的菌落2周圍沒(méi)有水解圈。上述結(jié)果均表明，整合載體通過(guò)同源雙交換重組將P43-SjLys整合到B. subtilisWB600基因組DNA上，成功構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)B. subtilisWB600/P43-SjLys。

2.3 SjLys蛋白在B. subtilisWB600/P43-SjLys中表達(dá)通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌體濁度（A = 600 nm），分別繪制B. subtilisWB600和B. subtilis

WB600/P43-SjLys菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線（圖 5-A）。結(jié)果（圖 5-A）表明，α-淀粉酶不是B. subtilis正常生長(zhǎng)的必需因子，所以敲除淀粉酶基因并不會(huì)影響B(tài). subtilis的生長(zhǎng)和繁殖。B. subtilisWB600/P43-SjLys的生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)也表明，培養(yǎng)了48 h左右的菌株已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，繼續(xù)再發(fā)酵一段時(shí)間，約60 h后，由于菌體活力及培養(yǎng)基養(yǎng)不充足等因素，導(dǎo)致?lián)u瓶?jī)?nèi)菌體的整體生長(zhǎng)停滯，菌體濃度下降。

將B. subtilisWB600/P43-SjLys和B. subtilisWB600活化培養(yǎng)，約14-16 h。按1%的接種量將菌種擴(kuò)大培養(yǎng)。根據(jù)菌體的生長(zhǎng)曲線，選取不同培養(yǎng)時(shí)間24、36 、 48和60 h的發(fā)酵液，離心收集菌體。SjLys蛋白含有125個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量約為14.14 kD。SDS-PAGE結(jié)果（圖5-B）顯示，與對(duì)照B. subtilisWB600相 比，B. subtilisWB600/P43-SjLys培養(yǎng)36 h后的樣品，在14.3 kD附近隱約多出一條特異性蛋白帶，其分子量與SjLys類似，這表明B. subtilisWB600/P43-SjLys已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)SjLys蛋白（圖5-B，lane 4）。條帶顏色很淺，說(shuō)明SjLys蛋白濃度較低。培養(yǎng)48 h后的樣品，條帶的顏色加深，SjLys蛋白的表達(dá)量有所增加（圖 5-B，lane 5）；至60 h時(shí)，目的條帶顏色明顯加深，表明SjLys蛋白的表達(dá)量增多（圖 5-B，lane 6）。上述結(jié)果表明，SjLys蛋白在宿主中得到可溶表達(dá)。

2.4 檢測(cè)抑菌活性

培養(yǎng)60 h菌體，超聲破碎后取上清液，用濾紙片法檢測(cè)抑菌活性。結(jié)果（圖6）表明，與空宿主B. subtilisWB600微弱的抑菌活性相比較，B. subtilisWB600/P43-SjLys破碎、離心后的上清液對(duì)指示菌金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌均有明顯的抑菌作用。表明B. subtilisWB600/P43-SjLys能夠表達(dá)可溶的，具有生物學(xué)功能即抑菌活性的SjLys蛋白。

圖 5 菌株B. subtilis WB600和B. subtilis WB600/P43-SjL-ys生長(zhǎng)曲線（A）及SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)（B）

圖6 轉(zhuǎn)化子B. subtilis WB600/P43-SjLys和陰性對(duì)照WB600細(xì)胞破碎后的上清液抑菌活性的檢測(cè)

3 討論

3.1 SjLys表達(dá)宿主的選擇

目前，體外得到的具有活性的SjLys蛋白，幾乎全部來(lái)自于E. coli表達(dá)系統(tǒng)［5-7］。但是，SjLys蛋白如果不結(jié)合融合標(biāo)簽（Trx），在宿主體內(nèi)幾乎均以包涵體形式存在［6，7］。對(duì)于E. coli的部分表達(dá)系統(tǒng)，若外源蛋白編碼序列中含有稀有密碼子，則會(huì)造成表達(dá)量低，或者翻譯提前終止。由于SjLys蛋白的cDNA上存在7個(gè)稀有密碼子，因此表達(dá)宿主只能局限在E. coliRosetta系列，如Rosetta-（DE3）pLysS和Rosetta-GamiB（DE3）pLysS［6］。

與大腸桿菌系統(tǒng)相比，新興的B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)沒(méi)有明顯的密碼子偏愛(ài)性，表達(dá)產(chǎn)物也不容易形成包涵體［10，11］。選擇更加合理的新宿主，對(duì)于

SjLys蛋白的外源可溶表達(dá)具有重要的作用，因此本研究將選取B. subtilisWB600作為SjLys蛋白的表達(dá)宿主。但是，作為基因工程宿主菌，B. subtilis在滾環(huán)復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生大量λ噬菌體的單鏈DNA，細(xì)胞分裂時(shí)這些單鏈DNA就會(huì)引起質(zhì)粒丟失，因此很難維持胞內(nèi)質(zhì)粒的穩(wěn)定傳代。本研究利用整合質(zhì)粒pDG1730，將SjLys基因通過(guò)同源雙交換重組整合到B. subtilisWB600的染色體上。一方面，能維持外源基因的連續(xù)傳代，避免由于質(zhì)粒丟失而出現(xiàn)蛋白表達(dá)不穩(wěn)定的情況；另一方面，也能減少抗生素的使用，避免相應(yīng)的食品安全問(wèn)題［14］。

3.2 SjLys表達(dá)量的優(yōu)化

從上述試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SjLys蛋白的表達(dá)量還不足以實(shí)現(xiàn)海參溶菌酶的外源高效、可溶表達(dá)。后續(xù)的工作將需要優(yōu)化表達(dá)體系，提高SjLys蛋白的表達(dá)量。

研究已經(jīng)表明，在B. subtilis中外源蛋白和啟動(dòng)子之間存在有適配性的問(wèn)題，啟動(dòng)子是外源基因表達(dá)的重要元件，對(duì)蛋白的表達(dá)具有重要影響。B. subtilis已知的σ因子有12種，分別識(shí)別不同的啟動(dòng)子序列。在以B. subtilisWB600作為宿主菌來(lái)表達(dá)外源蛋白的研究中，使用較多的啟動(dòng)子有組成型表達(dá)的雙啟動(dòng)子P43［15-19］、需要蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)的果聚糖蔗糖酶基因SacB的啟動(dòng)子［20，21］以及解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子［22］。本試驗(yàn)?zāi)壳笆褂玫膩?lái)源于枯草芽孢桿菌自身的強(qiáng)啟動(dòng)子P43。為獲得更高的蛋白表達(dá)量，后續(xù)可以構(gòu)建不同的啟動(dòng)子與SjLys的表達(dá)系統(tǒng)，檢測(cè)啟動(dòng)子與SjLys蛋白的適配性，比較蛋白的表達(dá)量以及抑菌活性，以期得到更好的試驗(yàn)結(jié)果。但是，在B. subtilis中，蛋白的表達(dá)量不僅和啟動(dòng)子有關(guān)，還與整合位點(diǎn)和整合劑量相關(guān)，因此還需要進(jìn)一步篩選、設(shè)計(jì)適合SjLys蛋白與啟動(dòng)子之間的整合位點(diǎn)，嘗試改變啟動(dòng)子與目的序列之間的核苷酸數(shù)量以提高蛋白的表達(dá)水平。

4 結(jié)論

通過(guò)同源雙交換重組，將海參溶菌酶基因整合到B. subtilis基因組上，構(gòu)建了海參溶菌酶蛋白的枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)。在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)之外，首次成功地在體外獲得了海參溶菌酶全長(zhǎng)蛋白的可溶表達(dá)，為生產(chǎn)海參溶菌酶后續(xù)的研究和開(kāi)發(fā)工作提供了一個(gè)新的途徑。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Integrative Expression of Stichopus japonicus Lysozyme Gene in Bacillus subtilis

Li Dan Li Cheng Sun Lu Zou Dan Liu Zhiwen Cong Lina
（School of Biology Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034）

In this study, we cloned promoter P43 of B. subtilis in the front of Lysozyme from Stichopus japonicus（SjLys） gene by constructing the recombinant plasmid pMD18-P43-SjLys. Then we obtained the integration plasmid pDG-P43-SjLys of B. subtilis by subcloning the P43-SjLys fragment into the plasmid of pDG1730. We transformed the linear integration plasmid digested by Xho I into B. subtilis WB600, and selected the re-combinant strain by Spc resistance screening and amylase activity negative screening. After incubation at 37℃, 220 r/min in LB medium, the cellular lysate of this strain was detected by the SDS-PAGE assay. The results demonstrated that B. subtilis WB600/P43-SjLys successfully expressed soluble SjLys after incubated for 60 h. The cellular lysate of B. subtilis WB600/P43-SjLys displayed inhibitive effect on the growth of the Micrococcus lysodeikticus and Staphylococcus aureus. In this study, we expressed SjLys gene integratedly in B. subtilis for the first time, and proposed a potentially new way of producing SjLys protein.

Lysozyme of Stichopus japonicus Bacillus subtilis Promoter 43 Homologous recombination Integrative expression

2014-01-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31072224），遼寧省高等學(xué)校重大科技平臺(tái)專項(xiàng)（LT2011008）

李丹，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物技術(shù)；E-mail：804484017@qq.com

叢麗娜，女，教授，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)的研究和開(kāi)發(fā)；E-mail：linacong@163.com