韓巖巖宋德光

（1.遵義醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，遵義563003；2. 吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，長春 130062）

VSV糖蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構建及其自激活作用的檢測

韓巖巖1宋德光2

（1.遵義醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，遵義563003；2. 吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，長春 130062）

構建水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）酵母雙雜交誘餌載體，檢測其在酵母細胞中的表達和自激活作用，為進一步研究酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與VSV-G相互作用蛋白奠定基礎。通過RT-PCR方法從水泡性口炎病毒（VSV）克隆糖蛋白（G）基因，BamH I和Sal I雙酶切后連接誘餌載體pSos，獲得誘餌質粒pSos-VSV-G，經測序鑒定后pSos-VSV-G轉化到酵母菌株cdcH25（α），在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中觀察pSos-VSV-G的自激活作用和毒性作用，同時利用蛋白印跡法分析誘餌蛋白的表達。成功擴增VSV-G基因，并準確克隆入pSos中，誘餌載體pSos-VSV-G成功轉化到酵母菌株cdcH25（α）中，經表型篩選檢測無自激活作用和毒性作用，蛋白印跡法檢測證實pSos-VSV-G在酵母細胞中表達誘餌蛋白。 可以利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與VSV-G相互作的蛋白質。

水泡性口炎病毒 糖蛋白 酵母雙雜交 誘餌載體

水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）是引起人和多種哺乳動物水泡性口炎（Vesicular stomatitis，VS）的病原［1］。VSV感染人或動物后主要以口腔粘膜、舌、唇、乳頭和蹄冠部上皮發(fā)生水泡為特征，其臨床癥狀與口蹄疫（FMD）、豬水泡?。⊿VD）等極為相似，在獸醫(yī)臨床上容易被誤診［2］。已有的大量研究顯示［3］，VSV與其宿主細胞表面受體的結合而吸附在宿主細胞膜上這是病毒感染的第一必備步驟。研究發(fā)現VSV囊膜G蛋白是病毒吸附至細胞特異性受體的配體蛋白［4］。近年來，對VSV分子致病機制的研究成為焦點，其中對細胞膜受體研究已經成為目前水泡性口炎病毒研究中的重點領域。根據VSV具有廣泛的嗜上皮性，推測磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）可能是VSV的特異

性受體。2004年，David等［5］用錨定蛋白的方法預先與細胞膜的PS結合后再進行試驗，結果發(fā)現VSV仍能感染細胞，因此提出PS不是VSV細胞膜表面受體的觀點，只是在VSV感染后膜融合過程中起重要作用。上述的觀點提示我們，在宿主細胞膜表面可能存在有VSV的未知受體，因此，尋找并鑒定細胞膜上的未知受體對于闡明VSV確切的分子致病機制及防治該病意義重大。

本研究擬利用分子生物學技術，將VSV囊膜G蛋白基因克隆到酵母雙雜交系統(tǒng)pSos誘餌載體上，構建應用于酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌質粒，然后將其轉入酵母溫度缺陷株，在排除VSV-G蛋白對cdcH25（α）細胞的自激活作用后，可以將該誘餌質粒用于酵母雙雜交篩選系統(tǒng)［6，7］，篩選與VSV囊膜G蛋白相互作用的受體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和質粒 水泡性口炎病毒（VSV-IN株）由本實驗室保存；質粒pSos、pSosMAFB、pMyrMAFB、pMyrC和cdcH25（α）酵母菌株購自Stratagene公司；DH5α大腸桿菌菌株由本實驗室保存；pMD-18T Simple載體、生物化學試劑購自TaKaRa及Invitrogen公司。

1.1.2 試劑和主要儀器 葡萄糖、半乳糖、二甲基亞砜、蛋白Maker、Yeast extract、Bacto pepton、Agar、PEG3350、醋酸鋰、Tris堿、裂解液（Lysis Buffer）等購自Sigma 公司。PCR擴增儀新加坡產2700型產品；超聲波細胞粉碎機為無錫市上佳生物科技有限公司GA92-ⅡDB型產品；凝膠成像系統(tǒng)（TFP-M/WL）法國產；生化培養(yǎng)箱（HPS-250）產哈爾濱。

1.2 方法

1.2.1 VSV-G基因的克隆 設計上游含有BamH I酶切位點的引物序列：5'-CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTAC-3'；下游含有SalI酶切位點的引物序列：5'-ACGCGTCGACTAAGATGAAGATCGGAGT-3'。 提取VSV總RNA作為模板進行RT-PCR反應，擴增產物經瓊脂糖電泳分析。

1.2.2 重組質粒pMD18T-VSV-G的構建及鑒定 利用凝膠回收試劑盒回收PCR產物，按T載體試劑盒說明，將產物與pMD18T simple載體連接。用CaCl2法轉化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，使用氨芐抗性板篩選陽性菌落并擴增、抽提質粒，經PCR和酶切分析鑒定插入片段大小，并進行測序鑒定。

1.2.3 誘餌重組質粒的構建及鑒定 將已構建的pMD18T-VSV-G及酵母表達載體pSos分別用BamH I和SalI雙酶切處理，瓊脂糖電泳回收純化目的片段和載體片段。經T4連接酶連接，用CaCl2法轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，使用氨芐抗性板篩選陽性菌落并擴增、抽提質粒，雙酶切鑒定陽性質粒。重組誘餌質粒命名為pSos-VSV-G，用酵母表達載體pSos的引物，其上游引物為5'-CCAAGACCAGGTACCATG-3'，下游引物5'-GCCAGGGTTTTCCCAGT-3'，送北京英駿生物公司進行序列測定。

1.2.4 誘餌載體的毒性檢測 利用醋酸鋰轉化法，取新制備好的酵母感受態(tài)細胞，向裝有酵母感受態(tài)細胞的離心管中加入鮭魚精DNA 10 μL，再加入重組誘餌質粒pSos-VSV-G，輕輕顛倒混勻，室溫作用20 min。然后再分別加入20 μL 10×TE（Tris-EDTA），20 μL 10×LiAc（醋酸鋰）和200 μL 50% PEG3350，輕輕顛倒混勻。將離心管置于24℃條件下，以225 r/min 轉速，培養(yǎng)45 min。然后向每管中再加入30 μL 二甲基亞砜，輕輕混勻。42℃條件下熱激15 min，期間間斷混勻，立即置于冰浴冷卻5 min。8 000 r/min離心15 s，棄去上清液。用0.5 mL 1×TE重懸沉淀，吸取100 μL菌液滴于SD/glucose（-Leu）培養(yǎng)基上，倒入滅菌的玻璃珠晃動平板，使菌液均勻涂布于培養(yǎng)基上，待菌液吸干后，傾倒玻璃珠。然后將平板置于24℃條件下倒置培養(yǎng)4-6 d，觀察菌落的生長情況。

1.2.5 誘餌載體的自激活檢測和載體定位檢測 共轉化試驗分為5組進行。其中，第1組：pSosMAFB質粒（0.5 μg）和 pMyrMAFB（0.5 μg）為陽性對照組1，第2組：pSosMAFB質粒（0.5 μg）和pMyrSB（0.5 μg）為陽性對照組2，第3組：pSosMAFB質粒（0.5 μg）和pMyrC（0.5 μg）為陰性對照組，第4組：pSos-VSV-G（0.5 μg）和pMyrC（0.5 μg）為自激活檢測組，第5組：pSos-VSV-G（0.5 μg）和

pMyrSB（0.5 μg）為載體定位檢測組。利用醋酸鋰方法進行轉化試驗，最后分別吸取100 μL菌液均勻涂布于SD/glucose（-Ura，Leu）平板上，將平板倒置于24℃條件下培養(yǎng)4 d左右，在此期間觀察菌落的生長情況，直至有菌落長出。每板分別挑取5個菌落，分別用30 μL滅菌水重懸，每份吸取2.5 μL重懸菌液，然后分別滴于2個SD/glucose（-Ura，Leu）平板和1個SD/galactose（-Ura，Leu）平板。其中，1個SD/ glucose（-Ura，Leu）平板置于24℃條件下，另外1個SD/glucose（-Ura，Leu）平板和1個SD/galactose（-Ura，Leu）平板同時置于37℃條件下培養(yǎng)4-6 d，在此期間觀察菌落的生長情況。

1.2.6 誘餌融合蛋白 Western blot分析

1.2.6.1 酵母菌表達融合蛋白的提取 利用醋酸鋰轉化法，分別進行3組試驗。第1組：轉化含有pSos 空載體（0.5 μg）的載體蛋白對照組；第2組：轉化含有誘餌質粒的作為試驗組；第3組：不轉化任何質粒的空白對照組。將第1組和第2組的轉化菌液分別涂布于YPAD平板和SD/glucose（-Leu）平板上，進行篩選。在24℃條件下倒置培養(yǎng)4-6 d，觀察菌落的生長情況。待菌落直徑大于2 mm時，挑取單個菌落，分別接種于10 mL的YPAD液體培養(yǎng)基和SD/glucose（-Leu）液體培養(yǎng)基中，然后置于24℃ 搖床，以225 r/min，振蕩培養(yǎng)，直至菌液OD值在0.6-0.8之間。將菌液以5 000 r/min，離心10 min，收集酵母細胞，棄去上清液。然后加入400 μL的裂解液（Lysis Buffer）裂解細胞，重懸沉淀；然后加入相同體積的直徑為0.5 mm酸洗玻璃珠混勻，冰浴放置10 min，漩渦振蕩10 min，4℃進行超聲破碎，功率為600 W，時間為20 min，進行超聲破碎時間為每次10 s，中間間歇14 s 。最后將超聲破碎后的液體，12 000 r/min，4℃，離心10 min，小心吸取上清液，即為蛋白提取物。

1.2.6.2 蛋白印跡檢測 首先進行SDS-PAGE分析，然后將分離的蛋白質樣品，轉移到硝酸纖維素膜NC膜上，用脫脂乳封閉過夜，然后加入一抗（鼠抗Sos蛋白抗體），37℃孵育2 h，然后加入酶標二抗反應物（羊抗鼠HRP-IgG），37℃孵育1 h，經過底物化學發(fā)光ECL顯色。

2 結果

2.1 VSV-G基因的克隆、載體構建及鑒定

2.1.1 VSV-G基因的克隆 提取病毒總RNA后經RT-PCR擴增、電泳，可見一條特異性帶，大小在1 200 bp左右，與預期VSV-G基因1 242 bp大小近似（圖1），可初步判斷為目的基因片段，并將其回收。將該特異性條帶回收后與pMD18T載體連接獲得的重組質粒，采用特異性引物對重組質粒pMD18TVSV-G目的基因進行PCR擴增和重組質粒進行雙酶切鑒定（圖2），所獲得目的基因片段和酶切片段大小均與理論值相符。經測序比對證實為VSV-G基因，全長1 242 bp，提示VSV-G基因擴增以及pMD18TVSV-G載體構建成功。

圖1 VSV-G基因的RT-PCR擴增結果

圖2 重組質粒pMD18T-VSV-G的PCR和酶切鑒定結果

2.1.2 誘餌載體的構建 將pMD18T-VSV-G與和pSos空載體分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切?；厥漳康钠魏蚿Sos載體片段用T4連酶連接轉化大腸桿菌。隨機挑取陽性克隆，搖菌提取質粒，對構建的誘餌質粒進行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定（圖3），酶切片段大小均與理論值相符，測序結果表明插入的核苷酸序列正確。

圖3 誘餌質粒雙酶切電泳圖

2.2 誘餌載體毒性、自激活作用檢測及融合蛋白表達

2.2.1 pSos-VSV-G對酵母菌的毒性檢驗 轉化了pSos-VSV-G質粒的cdc25H（α）在SD/glucose（-Leu）

培養(yǎng)基上生長良好（圖4），說明pSos-VSV-G質粒的表達產物對酵母菌的生長沒有毒性作用，為下一步的試驗奠定了基礎。

圖4 酵母菌株cdc25H（α）的生長情況

2.2.2 誘餌重組質粒的自激活檢測和載體定位情況檢驗結果 結果顯示，24℃條件下，5組在SD/ glucose（-Ura，Leu）平板均長出菌落。 37℃條件下，5組在所有SD/glucose（-Ura，Leu）培養(yǎng)基，均無菌落生長。然而在SD/galactose（-Ura，Leu）平板生長情況有所不同。結果（表1）顯示，第1組、第2組和第5組，均在SD/galactose（-Ura，Leu）平板上長出菌落。然而第3組和第4組，在SD/galactose（-Ura，Leu）營養(yǎng)缺陷板上無菌落生長（表1）。上述試驗結果表明誘餌重組質粒在宿主酵母菌株cdc25H（α）的中無自激活作用，并且誘餌重組質粒在宿主酵母菌株cdc25H（α）細胞質中表達的融合蛋白定位結果正確。

表1 誘餌載體的自激活情況及定位情況檢驗

2.2.3 誘餌重組質粒融合蛋白表達結果 對轉化有pSos空載體質粒和有誘餌重組質粒的單菌落以及未轉化任何質粒的酵母菌搖菌提取總蛋白，然后分別進行SDS-PAGE分析，Western blot分析，應用ECL化學發(fā)光方法進行顯影，結果（圖5）表明，誘餌重組質粒成功表達融合蛋白，融合蛋白分子量約為170 kD。

圖5 酵母表達的誘餌融合蛋白的Western印跡鑒定結果

3 討論

水泡性口炎是由水泡性口炎病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性的人畜共患傳染病。以在口腔粘膜、舌、唇、乳頭和蹄冠部上皮出現水泡為特征［1］。水泡性口炎病毒顆粒由脂質雙層外膜、基因組RNA和核蛋白N、P蛋白、M蛋白、L蛋白和G蛋白組成。G蛋白與病毒入侵細胞有關。關于VSV是通過病毒囊膜糖蛋白突起吸附于敏感細胞表面受體，目前還存在爭論。然而，G蛋白的寡糖鏈與病毒吸附無關，因為病毒粒子在其G蛋白缺少寡糖鏈的情況下，仍然具有完全的感染性。VSV的侵入和脫殼發(fā)生在吸附之后，雖然病毒吸附不需要對能量

和生理溫度的依賴，但侵入卻是一個能量和生理溫度依賴的過程?，F在普遍認為VSV是由胞吞作用而侵入的，并且隨著內吞小泡內pH值降低，G蛋白可以介導和啟動膜融合并脫去病毒包膜，于是病毒核衣殼釋放到胞質中。G蛋白上含有2個糖基化位點，是病毒的主要表面抗原，決定著病毒的毒力，也是病毒的保護性抗原。它可刺激機體產生中和抗體，呈現型、亞型，乃至株的特異性［6］。G蛋白在病毒吸附在宿主細胞中以及病毒從宿主中出芽釋放起到了重要作用，與病毒吸附到宿主細胞受體有關的病毒成分是糖蛋白。當選擇性的蛋白溶解以去除VSV糖蛋白時，便會降低病毒的感染性，并且抗糖蛋白的抗體能有效的中和該病毒。

酵母雙雜交系統(tǒng)［7，8］作為一種分析蛋白質與蛋白質之間相互作用的簡便而有效的研究體系，具有許多優(yōu)點，如采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達，并且避免蛋白質純化過程。檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用是在活細胞內進行，體現真核細胞內真實反應情況，并且可以檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。而不像體外蛋白質之間相互作用，受蛋白的濃度親和力等限制。酵母雙雜交系統(tǒng)還可采用不同細胞類型、組織、器官和分化時期材料構建cDNA文庫。易于轉化、便于回收擴增質粒，具有可直接進行選的標記基因和特征性報道基因。

本試驗選用的是Stratagene CytoTrapTM雙雜交系統(tǒng)，也就是SOS恢復系統(tǒng)（SRS）［9］，該系統(tǒng)具有傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)不具備的優(yōu)點，檢驗的蛋白質間相互作用發(fā)生在酵母細胞質中。因此該系統(tǒng)適于研究非核蛋白，膜蛋白等［10］。Stratagene CytoTrapTM雙雜交系統(tǒng)中使用的是溫度敏感突變型酵母株cdc25H（α），該菌株位于1 328位氨基酸殘基CDC25基因存在突變，由于CDC25基因是編碼酵母細胞中鳥氨酸交換因子的基因，該基因的突變使得Ras信號轉導通路中斷。酵母菌株cdc25H由于CDC25基因是突變的，不能激活Ras信號轉導通路，因此不能在限制性溫度37℃生長。但仍然可以在22-25℃左右的室溫條件下正常生長［11］。在SOS恢復系統(tǒng)中，pSos載體被用于構建誘餌質粒的載體，其閱讀框中包含編碼hSos蛋白DNA氨基酸的序列，hSos蛋白表達并錨定在細胞膜上，可以彌補CDC25基因的缺陷，激活Ras信號轉導通路，導致該酵母菌株cdc25H（α）可以在限制性溫度37℃正常生長。這樣，利用pSos載體的這一性質，可以在多克隆位點插入想要的目的片段作為誘餌序列，hSos和誘餌序列一起表達為融合蛋白，如果誘餌與錨定在細胞膜上的獵物蛋白的之間發(fā)生相互作用。使得hSos蛋白間接錨定在細胞膜上，從而激活Ras信號轉導通路。并且pSos載體可以在酵母中表達LEU2基因，可以在大腸桿菌中表達氨芐抗性，從而便于在酵母和大腸桿菌中挑取陽性克?。?2］。

4 結論

本試驗成功構建誘餌重組質粒，該誘餌重組質粒無自激活作用，從酵母菌株cdc25H（α）的生長情況來看，誘餌質粒對酵母菌株cdc25H（α）無毒性作用。對轉化有誘餌重組質粒的單菌落進行搖菌提取總蛋白，結果表明誘餌質粒能夠在酵母細胞質中成功表達融合蛋白。該誘餌質粒可以應用于酵母雙雜交系統(tǒng)。

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（責任編輯 李楠）

Construction of a Bait Vector for VSV Glycoprotein and Evaluation of Its Self-activation in Yeast Two-hybrid System

Han Yanyan1Song Deguang2
（1. School of Public Health，Zunyi Medical University，Zunyi 563003；2. College of Animal science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062）

It was to construct a bait vector for vesicular stomatitis virus glycoprotein（VSV-G）and detect its protein expression and selfactivation activity in yeast cells, as a basis for further study of screening and VSV-G protein interaction in two hybrid system. Fragment of VSV-G gene were amplified using RT-PCR and directly ligated to pSos vector, insert-contained plasmid was confirmed by restriction endonuclease analysis and DNA sequencing. The self-activation and toxicity of the bait plasmid transformed into the yeast cells cdcH25（α）was observed in selective culture medium, and the bait protein was confirmed by Western blot. Results showed that VSV-G gene was found in the reconstructed plasmid pSos-VSV-G by sequencing. Yeast two-hybrid tests showed that yeast cells cdcH25（α）transfected with pSos showed that VSV-G had no self-activation and toxicity, the expression of bait protein was confirmed by Western blot. The yeast two-hybrid system can be applied to screen the interacting proteins of VSV-G.

Vesicular stomatitis virus Glycoprotein Yeast two-hybrid Bait plasmid

2013-12-28

貴州省科學技術基金項目（黔科合J字［2013］2313號），遵義醫(yī)學院博士啟動基金項目（F-584）

韓巖巖，女，博士，研究方向：分子營養(yǎng)學和營養(yǎng)相關疾?。籈-mail：hanyanyan1984@126.com