孫亭亭冀斌馬志亮胡文麗魯瓊芬張雄偉陳培富

（1.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201；2. 云南省紅河州金平縣畜牧局，金平 661500）

紅色原雞外周血單個核細胞IFN-γ的誘導表達及其熒光定量PCR檢測

孫亭亭1冀斌1馬志亮1胡文麗1魯瓊芬1張雄偉2陳培富1

（1.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201；2. 云南省紅河州金平縣畜牧局，金平 661500）

為建立檢測紅色原雞外周血單個核細胞（PBMC）中干擾素γ（IFN-γ）mRNA表達水平的方法，通過優(yōu)化刀豆蛋白A（Con A）誘導PBMC表達IFN-γ的條件，采用RT-PCR方法以3-磷酸甘油脫氫酶（GAPDH）基因為內參擴增IFN-γ基因，插入克隆載體pMD18-T分別構建重組質粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH，以其作為標準品采用SYBR Green I染料法建立熒光定量PCR檢測方法，并將該方法應用于34只紅色原雞PBMC IFN-γ表達量的檢測。結果發(fā)現(xiàn)，PBMC在20 μg/mL Con A刺激培養(yǎng)12 -25 h 時IFN-γ處于高表達水平；標準品質粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH分別在拷貝數(shù)6.72×102-6.72×109、3.94×102-3.94×109范圍內與其對應的Ct值呈現(xiàn)良好的線性關系（R2＞ 0.99），擴增產物的熔解曲線均只有特異的單峰，表明所用引物特異性強。在優(yōu)化Con A誘導紅色原雞PBMC表達IFN-γ條件的基礎上，建立了可用于定量檢測紅色原雞PBMC IFN-γ mRNA表達水平的熒光定量PCR方法。

紅色原雞 干擾素γ Con A誘導 熒光定量PCR 外周血單個核細胞

紅色原雞屬于原雞屬（Gallus gallus），被認為是家雞唯一的祖先［1］，主要分布于東南亞一帶。紅色原雞有5個亞種［2］，其中海南亞種（G. g. jabouillei）和滇南亞種（G. g. spadiceus）分布于中國，前者主要分布于海南、廣西及云南東南部，后者多分布于云南西部、西南部和南部，尤以西雙版納最為集中。版納紅色原雞在當?shù)厮追Q茶花雞，具有野性足、抗病力強、耐粗放飼養(yǎng)、適應性廣、繁殖力強、能與

家雞雜交產生有繁殖力的后代等特點［3］。紅色原雞作為一個重要的禽類品種資源，應用潛力很大，隨著人們對動物資源保護意識的提高和育種技術的發(fā)展，針對紅色原雞的研究也越來越受到重視。

干擾素γ（Interferon-gamma，IFN-γ）是Ⅱ型干擾素，能夠激活巨噬細胞分泌抗炎癥因子、刺激MHCⅡ類分子的表達，促進B細胞分化、產生抗體及轉換免疫球蛋白類別，比Ⅰ型干擾素具有更強的免疫調節(jié)功能［4］。IFN-γ作為抗原提呈細胞和淋巴細胞增殖、分化的調節(jié)劑參與細胞炎癥反應和抗病毒免疫，其高表達量對病毒的清除有重要的作用［5］。IFN-γ主要由大顆粒淋巴細胞和活化的T細胞分泌，未經刺激時表達量極低［6-8］，但當動物機體受到病毒、有絲分裂原、RNA、特異性抗原等刺激時，T細胞被活化，暫時性高表達IFN-γ。因此，IFN-γ常作為細胞免疫系統(tǒng)活化的指標，通過檢測IFN-γ的表達量，了解免疫系統(tǒng)的活化水平，為評價機體的免疫狀態(tài)提供依據(jù)［9，10］。實時熒光定量PCR檢測技術具有準確、快速、高效、高度敏感和特異等優(yōu)點，能夠從mRNA水平檢測細胞因子的表達，成為當今備受關注的研究手段。本研究優(yōu)化Con A誘導紅色原雞PBMC表達IFN-γ的最佳條件，建立熒光定量PCR檢測IFN-γ mRNA相對表達量的方法，并初步應用于34只紅色原雞的臨床檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 云南省德宏、普洱、紅河地區(qū)共收集成年紅色原雞34只。

1.1.2 主要試劑和儀器 雞外周血淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限公司）；Con A（北京華邁科生物技術有限責任公司）；改良型RPMI-1640細胞培養(yǎng)液（HyClone）；胎牛血清（BioInd）；青鏈霉素（BioInd）；RT-PCR相關試劑、pMD-18T克隆載體、感受態(tài)細胞DH5α及工具酶（TaKaRa）；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）。主要儀器有Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀、紫外分光光度計、低溫離心機及凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBanK提供的雞IFN-γ基因序列（NM_205149.1）及GAPDH基因序列（NM_204305）分別設計標準品引物和熒光定量引物（表1），由寶生物（大連）生物工程有限公司合成。

表1 標準品引物和熒光定量PCR引物的核苷酸序列

1.2.2 PBMC分離培養(yǎng)及Con A誘導IFN-γ表達條件的優(yōu)化 雞翅下靜脈采集抗凝血3 mL，3 000 g/min離心10 min后棄上層血漿，按1∶1（體積比）滅菌生理鹽水重懸細胞，將其平鋪于等體積的PBMC分離液的上層。3 000 g/min離心15 min后，小心吸出中間層的PBMC置于滅菌離心管中。滅菌生理鹽水洗滌2-3次，離心棄上清，細胞重懸于改良型RPMI-1640培養(yǎng)液。顯微鏡下計數(shù)，調整細胞培養(yǎng)板上每孔的細胞數(shù)量為1×107個。為了優(yōu)化Con A誘導IFN-γ表達的條件，設計Con A終濃度為5、10、20、50 μg/mL共4個梯度，培養(yǎng)時間6 、12、21、25 、29、32、43、50、57、64、72 h共11個梯度，在每個時間點收集細胞并提取RNA，反轉錄后用引物IFN-F1/R1、GAPDH-F1/R1擴增IFN-γ和GAPDH基因，確定Con A誘導IFN-γ表達的最佳條件。

1.2.3 熒光定量PCR方法的建立

1.2.3.1 標準品的構建 將獲得的IFN-γ和GAPDH基因連接到克隆載體pMD18-T上，構建重組質粒pMD-IFNγ和pMD-GAPDH，轉化大腸桿菌DH5α，

語文是母語學科。語文課程標準明確指出：“語文課程應致力于學生語文素養(yǎng)的形成與發(fā)展。語文素養(yǎng)是學生學好其他課程的基礎，也是學生全面發(fā)展和終身發(fā)展的基礎?！币槐静坏?00頁的語文教材何以承擔如此之大的重擔呢？語文教師應與時俱進,改變簡單“教教材”的局面,而是“用教材教”。

經PCR鑒定篩選出陽性重組質粒作為標準品。紫外分光光度計測定標準品質粒的濃度和純度，按公式計算單位體積中質粒的拷貝數(shù)［copies=6.02×1023×（濃度/平均分子量）］，-80℃保存。

1.2.3.2 標準曲線的繪制 將標準品質粒以10倍梯度稀釋，取2 μL為模板用引物IFNG-F2/R2、GAPDH-F2/R2采用SYBR Green I染料法進行熒光定量PCR檢測，反應條件為95℃預變性30 s；變性95℃ 5 s、延伸60℃ 30 s共40個循環(huán)，每個循環(huán)結束時采集熒光信號。40個循環(huán)結束后將擴增產物進行熔解，程序為75℃至95℃，每0.2℃采集一次熒光信號，程序結束后繪制標準曲線與熔解曲線。

1.2.3.3 重復性和穩(wěn)定性試驗 選3個不同濃度的標準品各設4個重復進行熒光定量PCR檢測，計算組內變異系數(shù)評價其重復性。將樣品保存于-20℃，1周后再次進行熒光定量PCR檢測，計算組間變異系數(shù)評價其穩(wěn)定性。

1.2.4 方法的應用 采集34只紅色原雞的外周血3 mL/只，分離培養(yǎng)PBMC，以Con A誘導培養(yǎng)后刮取細胞提取總RNA并反轉錄，取2 μL cDNA為模板用引物IFN-F2/R2、GAPDH-F2/R2進行熒光定量檢測，同時將標準品pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH 以10倍倍比稀釋后進行定量PCR擴增，檢測結果采用“雙標準曲線法”計算每只雞IFN-γ的相對表達量。

2 結果

2.1 Con A誘導PBMC表達IFN-γ的最佳條件

PBMC經Con A誘導刺激后，在不同時間點收集細胞，RT-PCR擴增IFN-γ基因結果見圖1。結果顯示，Con A濃度為20 μg/mL刺激淋巴細胞培養(yǎng)6 h時已有IFN-γ表達，12 h時達到最高峰，29 h后開始下降，至64 h時普通RT-PCR已檢測不出，即20 μg/mL Con A刺激PBMC 12 -25 h為IFN-γ誘導表達的最佳條件。

2.2 重組質粒鑒定結果

將重組質粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH通過引物IFNG-F2/R2、GAPDH-F2/R2擴增分別得到113 bp與117 bp大小的條帶，與預期大小相符且條帶單一，可以作為熒光定量PCR的標準品（圖2）。使用紫外分光光度計檢測標準品質粒濃度和純度，pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH質粒濃度分別為12 ng/μL和7 ng/μL，根據(jù)公式計算可得質?？截悢?shù)分別為3.36×109copies/μL和1.97×109copies/μL，A260/280分別為1.91和1.87，表明質粒純度高。

圖1 Con A刺激PBMC各時間點IFN-γ基因RT-PCR鑒定結果

圖2 熒光定量PCR引物擴增結果

2.3 標準曲線的繪制

以10倍梯度稀釋的標準品質粒為模板，進行IFN-γ和GAPDH基因熒光定量PCR擴增，并繪制標準曲線和熔解曲線（圖3）。IFN-γ和GAPDH的Ct值與其質粒拷貝數(shù)在6.72×102-6.72×109和3.94×102-3.94×109范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)分別為R2=0.998和R2=0.999（圖3-A，3-B），熔解曲線分別只出現(xiàn)一個單峰（圖3-C），表明所用引物特異性高。

2.4 重復性與穩(wěn)定性分析

IFN-γ和GAPDH標準品3個稀釋度的組內變異系數(shù)分別為0.409%-0.977%、0.433%-0.999%（表2），均小于1%，表明同一樣品重復性好。組間變異系數(shù)分別為0.5%-1.28%和0.395%-1.093%，表明標準品穩(wěn)定性高。

圖3 IFN-γ和GAPDH標準曲線和熔解曲線的繪制

表2 IFN-γ和GAPDH標準品組內變異系數(shù)和組間變異系數(shù)

2.5 樣品檢測結果

用建立的熒光定量PCR方法檢測的34只紅色原雞PBMC IFN-γ和GAPDH基因（圖4）。測定結果以GAPDH內參進行校正，采用“雙標準曲線”法計算IFN-γ基因的相對表達量。以樣品1號作為基準將計算結果以柱狀圖顯示（圖5），其中表達量差異最大的為9號和11號雞，其IFN-γ表達量分別為1號雞的5.221倍和0.243倍，表明不同個體間受到相同刺激的情況下IFN-γ的表達量差異顯著。

圖4 34只紅色原雞IFN-γ和GAPDH基因熒光定量PCR擴增曲線

圖5 34只紅色原雞IFN-γ基因相對表達量

3 討論

IFN-γ是機體內在病毒防御和免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用的細胞因子，通過檢測IFN-γ的含量能夠為評價機體的細胞免疫狀態(tài)提供依據(jù)。在臨床試驗中，通過檢測IFN-γ的含量能夠診斷某些疾病，如通過檢測野生結核桿菌菌株特異性抗原誘導牛PBMC表達 IFN-γ水平，對判定牛結核的準確率可達93.6%，被澳大利亞農業(yè)常務委員會認定為牛肺結核官方診斷方法［11］。通過有絲分裂原體外誘導淋巴細胞能夠模擬動物機體受到抗原刺激時免疫應答的水平，目前常用Con A、植物血凝素（PHA）或佛波醇乙酯（PMA）誘導刺激雞胚、脾淋巴細胞表達IFN-γ［12-14］。這些方法得到的IFN-γ mRNA豐度高，易于擴增，但是耗時長、過程繁瑣，易污染。本研究對Con A誘導PBMC表達IFN-γ的條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)20 μg/mL Con A刺激12 -25 h 為IFN-γ表達高峰期，試驗周期較短，且外周血的采集比脾臟淋巴細胞的獲取簡單易行，有利于減少污染。

基因表達水平可在蛋白或基因兩種水平上進行

評價，在蛋白水平的檢測有ELISA、細胞內細胞因子染色等，在基因水平上有Northern雜交、RNA酶保護試驗等，這些方法的試驗周期相對較長，且敏感性相對較低［15］。熒光定量PCR技術提高檢測的敏感性和特異性，最低可檢測10個拷貝。SYBR Green I方法通用性好且價格低于探針法，但由于SYBR Green的結合特性，容易產生非特異性信號，所以對引物設計的要求比較高。本試驗建立的熒光定量PCR方法所用標準品質粒在1×102-1×109copies/μL范圍內相關系數(shù)高（R2＞0.99）；通過熔解曲線分析及重復性試驗證明該方法特異性強且重復性和穩(wěn)定性高。熒光定量PCR結果采用“雙標準曲線法”對目的基因進行相對定量，通過內參對目的基因的定量結果進行校正，消除采集樣品和RNA反轉錄操作過程中的誤差?！半p標準曲線法”具有試驗優(yōu)化相對簡單、數(shù)據(jù)分析準確等優(yōu)點［16］，但在每次試驗時都必需擴增標準品建立標準曲線，基于本研究建立的IFN-γ和GAPDH的標準曲線其擴增效率和相關性比較一致，在應用于大量樣品檢測時，可轉換為采用2-△△CT法計算相對表達量，使檢測方法更為簡便。

應用本研究建立的熒光定量PCR方法檢測了34只紅色原雞PBMC受到相同刺激后IFN-γ基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)最高表達量與最低表量之間相差25倍，說明不同個體間受到相同刺激后的免疫應答水平差異大，表明不同個體抗病毒病能力存在強弱差異。基因表達量的高低與基因多態(tài)性相關，已有大量研究證明人的IFN-γ基因存在多個能夠影響其表達量的多態(tài)性位點［17］，而且這些位點的多態(tài)性與某些疾病的易感存在相關性［18-20］。中國科學院北京基因組研究所將肉雞、蛋雞、烏骨雞與原雞的基因組框架圖進行比較，發(fā)現(xiàn)家雞和原雞之間有280多萬個SNPs，而且這些差異大部分產生于雞被人類馴化之前［21］，這表明原雞可能擁有比家雞豐富得多的基因多態(tài)性。國內還有學者對紅色原雞的mtDNA遺傳多樣性及部分基因座位的遺傳多樣性進行研究［22］，但未見對紅色原雞IFN-γ基因多態(tài)性及其與疾病易感性關系的研究報道。因此，將紅色原雞作為優(yōu)勢種質資源，找到影響IFN-γ表達差異的多態(tài)性位點，以期揭示其多態(tài)性影響表達量的分子機制，可為篩選抗病力強的IFN-γ基因型、培育出抗病品系提供科學依據(jù)。

4 結論

以20 μg/mL 的Con A刺激培養(yǎng)紅色原雞外周血單個核細胞（PBMC）12-25 h 為IFN-γ表達的最佳條件。建立的檢測IFN-γ表達水平的熒光定量PCR方法，其標準品質?？截悢?shù)在102-109范圍內與對應的Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關系（R2＞ 0.99），重復性與特異性強。將其應用于34只紅色原雞IFN-γ的檢測，發(fā)現(xiàn)不同個體受到相同刺激時IFN-γ表達水平存在較大差異。

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（責任編輯 李楠）

Induced Expression and Real-time PCR Detection of IFN-γ from PBMC in Red Jungle Fowl

Sun Tingting1Ji Bin1Ma Zhiliang1Hu Wenli1Lu Qiongfen1Zhang Xiongwei2Chen Peifu1
（1.College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Yunnan Kunming 650201；2. Bureau of Animal Production and Health，Yunnan Jinping 661500）

In order to establish the method for detection of interferon-gamma（IFN-γ）mRNA expression in PBMC of red jungle fowl（RJF）, the induction conditions of IFN-γ expression were optimized. IFN-γ gene and 3-phosphoric acid glycerol dehydrogenase（GAPDH）gene as an internal control were respectively amplified from the total RNA by RT-PCR and cloned into a pMD18-T vector, to obtain the recombinant plasmids（pMD-IFN-γ and pMD-GAPDH）which served as templates to map the standard curve of real-time PCR with SYBR Green I staining. This method was then applied to 34 RJF. The results showed that IFN-γ was expressed at high levels when PMBC were stimulated with 20 μg/mL of Con A for 12 - 25 h. A good linear correlation（R2＞0.99）was observed as the templates ranged from 6.72×102-6.72×109copies for IFN-γ and 3.94×102-3.94×109copies for GAPDH, and the melting curves presented single peaks, respectively. Based on the optimized condition of Con A-induced IFN-γ expression in PBMC, real-time PCR method was successfully established for quantitative analysis of RJF IFN-γ mRNA.

Red Jungle Fowl Interferon-γ Con A induction Real-time PCR PBMC

2013-12-20

國家自然科學基金項目（31060130）

孫亭亭，女，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)微生物學與免疫學；E-mail：sunting915@yeah.net

陳培富，男，博士，副教授，研究方向：獸醫(yī)微生物學與免疫學；E-mail：cltwins2003@163.com