趙欣梅吳樹(shù)彪王亦學(xué)崔貴梅王曉清杜建中王小麗尚勇進(jìn)孫毅，3

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031；3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

花青素合成調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因作為直觀標(biāo)記的載體構(gòu)建及其在玉米幼胚中的瞬時(shí)表達(dá)

趙欣梅1，2吳樹(shù)彪2王亦學(xué)2崔貴梅2王曉清2杜建中2王小麗1，2尚勇進(jìn)2孫毅1，2，3

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031；3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

采用花青素調(diào)控因子C1/Bperu分別與玉米胚特異性啟動(dòng)子Glb1和組成型啟動(dòng)子CaMV35S構(gòu)建成植物轉(zhuǎn)化載體pGlb1CB和p35SCB，并利用基因槍轉(zhuǎn)化方法，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米幼胚。顯微觀察結(jié)果證實(shí)，這兩個(gè)載體均能在玉米幼胚細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。用花青素作為標(biāo)記基因不僅可以在一定程度上減少公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因生物安全性方面的擔(dān)憂(yōu)，而且可以幫助直觀地從轉(zhuǎn)化當(dāng)代和后代種子中通過(guò)顏色標(biāo)記篩選到轉(zhuǎn)化籽粒，從而可以大大簡(jiǎn)化篩選程序，提高效率，節(jié)約檢測(cè)成本。

花青素 直觀標(biāo)記 載體構(gòu)建 瞬時(shí)表達(dá) 玉米幼胚

用［3］，故從轉(zhuǎn)基因植物營(yíng)養(yǎng)角度和安全性的方面來(lái)考慮，用花青素作為標(biāo)記對(duì)人和動(dòng)物是有益無(wú)害的。因其在植物中的廣泛存在，對(duì)自然環(huán)境也是安全的。

近年來(lái)關(guān)于花青素的研究主要集中在其生物合成途徑，代謝調(diào)控及生物學(xué)功能方面。近年來(lái)花青素用于轉(zhuǎn)基因中標(biāo)記基因的研究也有少數(shù)報(bào)道，在單子葉植物中，Doshi等［4，5］構(gòu)建了花青素調(diào)控因子Bperu、C1與胚特異啟動(dòng)子Ltp1的載體pLtp1CB并通過(guò)基因槍法轉(zhuǎn)入了小麥和小黑麥（小麥與黑麥的雜交麥）中，獲得了紫色胚的小麥和小黑麥轉(zhuǎn)化種子。Zale等［6］用Floral Dip方法將花青素調(diào)控基因Lc和C1作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記，在小麥上做了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，Shen等［7］通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將花青素調(diào)控因子Bperu、C1與玉米胚特異啟動(dòng)子globulin構(gòu)建的載體導(dǎo)入玉米，獲得了紫色胚的玉米轉(zhuǎn)化種子，宮硤等［8］用花青素代謝調(diào)控基因Bi和C1作為報(bào)告基因，以epsp作為篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建了植物表達(dá)載體 pBAC9009，用基因槍法獲得了紫色玉米植株。在雙子葉中， Kortstee等［9］用花青素作標(biāo)記進(jìn)行了蘋(píng)果，草莓和馬鈴薯的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)。

組成型啟動(dòng)子的活性高，在植物體的各組織中均有不同程度和持續(xù)的表達(dá)［8］。組織或器官特異型啟動(dòng)子專(zhuān)一性較強(qiáng)，使得外源基因在特定條件下或植株某個(gè)組織中表達(dá)，可以增強(qiáng)外源基因的表達(dá)效果，并能減少植株負(fù)擔(dān)，對(duì)作物的農(nóng)藝性狀影響也不明顯［10］。Glb1是一種控制玉米球蛋白合成的胚特異性表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子，它的表達(dá)受ABA調(diào)節(jié)，在玉米胚部表達(dá)量高［11-13］。本研究擬在Doshi提供的載體上進(jìn)行改造，用玉米球蛋白胚特異性啟動(dòng)子Glb1代替原有大麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白胚特異性啟動(dòng)子Ltp1，構(gòu)建適合于轉(zhuǎn)化玉米植株的載體pGlb1CB。此外，還利用CaMV35S代替Ltp1構(gòu)建載體p35SCB，以期得到具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)化載體，為植物基因轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)，并可為其他的轉(zhuǎn)基因研究作參考。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米自交系鄭-58由山西省強(qiáng)盛種業(yè)公司提供；載體pLtp1CB由Doshi教授（Agriculture and Agri-Food Canada，Lethbridge Research Centre，Canada）提供（圖1），載體pGlb1G由Scott教授（Interdepartmental Genetics，Iowa State University，Iowa，USA）提供，載體p35SBt由本實(shí)驗(yàn)室保存；pEasy-T載體、DH5α大腸桿菌、TaqDNA聚合酶購(gòu)自Transgene公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo公司；DNA膠回收試劑盒、Sanprep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自上海生工，PCR引物由上海生工合成；DNA序列由Invitrogen公司測(cè)定；普通生化試劑購(gòu)自艾德萊等公司?；驑屝吞?hào)為PDS-1000/He（Bio-Rad）。

圖1 載體pLtp1CB結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 方法

1.2.1 啟動(dòng)子功能驗(yàn)證 載體pGlb1G和pLtp1CB的基因槍瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè) 對(duì)載體pGlb1G的啟動(dòng)子Glb1測(cè)序并比對(duì)發(fā)現(xiàn)在470 bp處缺失了一個(gè)堿基T，為了證明缺失堿基是否會(huì)影響啟動(dòng)子功能，對(duì)該載體進(jìn)行基因槍瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)。同時(shí)對(duì)載體pLtp1CB也進(jìn)行了驗(yàn)證。取授粉后20 d左右的玉米優(yōu)良自交系鄭-58果穗，經(jīng)20%的次氯酸鈉表面消毒20 min后挑取其幼胚接種到MS培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，然后將其轉(zhuǎn)移到高滲MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)4 h后用基因槍轟擊。純化好的 pGlb1G和pLtp1CB載體調(diào)整濃度為3 μg/μL，制備基因槍微彈，并以不含任何質(zhì)粒其余均相同的微彈處理作為空白對(duì)照，轟擊幼胚。

馮一余顧不得聽(tīng)他們廢話，拿了鑰匙就發(fā)動(dòng)汽車(chē)，那女的正沖著樓上嚷呢，一聽(tīng)到發(fā)動(dòng)聲，立刻噤了聲，一回身以迅雷不及掩耳之勢(shì)，往車(chē)頭上一撲，喊，你開(kāi)，你開(kāi)！也不怕車(chē)頭上的灰塵臟了她的睡衣。

1.2.2 Glb1和CaMV35S基因啟動(dòng)子的克隆 根據(jù)GenBank中玉米球蛋白基因Glb1的序列（EF0649-79）設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物，在第一對(duì)引物的上游引物5'端加入BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物5'端加入AgeI酶切位點(diǎn)（下劃線部分）：Glb1/fw1：5'-GGATCCTA-

TTAGTCGTTAGCTTCTTTAAT-3'，Glb1/rv1：5'-ACCGGTGGGTTGGC-TGTATGCAGAACTAA-3'；在第二對(duì)引物的上游引物5'端加入XbaI的酶切位點(diǎn)，下游引物5'端加入Spe1的酶切位點(diǎn)（下劃線部分）：Glb2/fw2：5'-TCTAGATATTAGTCGTTAGCTTCTTTAAT-3'，Glb2/rv2：5'-ACTAGTGGGTTGGCTGTATGCAGAACTAA-3'。采用堿裂解法提取質(zhì)粒pGlb1G，以該質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增Glb1序列，瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收并純化后連接到pEasy-T載體上。獲得重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選并測(cè)序，利用NCBI對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)。同理克隆CaMV35S基因的啟動(dòng)子序列，合成的兩對(duì)引物分別為35S1/fw1：5'-GGATCCCTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAG-3'，35S1/rv1：5'-ACCGGTGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAG-3'；35S2/fw2：5'-TCTAGACTCGAGAGAGAT AGATTTGTAGAG-3'，35S2/rv2：5'-ACTAGTGAATCGGCCA ACGCGCGGGGAGAG-3'。

1.2.3 直觀表達(dá)載體的構(gòu)建 ①用BamH I和AgeI雙酶切質(zhì)粒pLtp1CB和pEasy-T-Glb1，酶切結(jié)果得到Glb1片段和含有Bperu/C1的載體大片段，用T4連接酶進(jìn)行連接，得到Glb1和Bperu/C1、Ltp1基因融合的載體pGlb1Ltp1CB（表1）。接著采用熱激法將該載體轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌中，用Glb1/fw1和Glb1/rv1進(jìn)行菌落PCR，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證和測(cè)序以驗(yàn)證連入片段的序列是否正確。至此，在原始的載體pLtp1CB上，有一個(gè)Ltp1啟動(dòng)子被置換成了Glb1。②用XbaI和SpeI雙酶切質(zhì)粒pGlb1Ltp1CB和pEasy-T-Glb2， 將 酶 切pEasy-T-Glb2得 到 的Glb2的片段和酶切質(zhì)粒pGlb1Ltp1CB得到的含有Bperu/C1基因的大片段，用T4連接酶進(jìn)行連接，得到Glb1和Bperu/C1基因融合的載體。同樣采用熱激法將該載體轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌中，用引物Glb2F和BperuR（5'-CCACGGAGTGGAGATCTTA-3'）菌落PCR檢測(cè)，將條帶大小正確的菌斑搖菌提取質(zhì)粒酶切并測(cè)序驗(yàn)證。從而構(gòu)建成了胚特異表達(dá)的載體pGlb1CB（圖2-A）。③同上述①和②中采用的方法，構(gòu)建組成型表達(dá)載體p35SCB（圖2-B）。

圖2 植物轉(zhuǎn)化載體pGlb1CB結(jié)構(gòu)（A）及p35SCB結(jié)構(gòu)（B）示意圖

表1 本研究中用到的質(zhì)粒及其基因組成

1.2.4 表達(dá)載體的基因槍瞬時(shí)表達(dá) 同1.2.3中所述的方法，將純化好的質(zhì)粒pGlb1CB、p35SCB、pLtp-1CB和Puc18濃度調(diào)整為3 μg/μL，用作制備基因槍微彈，轟擊幼胚并觀察，其中pGlb1CB和p35SCB為待檢測(cè)載體，pLtp1CB為陽(yáng)性對(duì)照，pUC18空載體為陰性對(duì)照，并設(shè)立了不含任何質(zhì)粒其余均相同的微彈作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 啟動(dòng)子功能驗(yàn)證

用載體pGlb1G和pLtp1CB制作的微彈轟擊玉米幼胚，接受轟擊的玉米幼胚在暗室25℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)在25℃光照下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。通過(guò)熒光顯微鏡觀察，用pGlb1G制作的微彈轟擊的玉米幼胚，在玉米幼胚中彈的部位呈現(xiàn)綠色熒光（圖3-A），在正常顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)以pLtp1CB制作微彈轟擊的玉米幼胚，在玉米幼

胚中彈的部位呈現(xiàn)紫紅色（圖3-B），而空白對(duì)照既不呈現(xiàn)綠色熒光也未表現(xiàn)紫色（圖3-C）。試驗(yàn)表明載體pGlb1G和pLtp1CB均能正常表達(dá)，可以進(jìn)行下一步構(gòu)建。

圖3 載體pGlb1G及載體pLtp1CB基因槍瞬時(shí)表達(dá)

2.2 Glb1和CaMV35S基因啟動(dòng)子的克隆

分別對(duì)質(zhì)粒pGlb1G和p35SBt進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩個(gè)同樣490 bp大小的片段Glb1、Glb2（圖4）和兩個(gè)同樣845 bp大小的片段35S1、35S2（圖5）。將擴(kuò)增片段分別連接到pEasy-T載體上，并用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。對(duì)獲得菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，從PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的菌落中提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定。各選10個(gè)酶切大小正確的菌落測(cè)序并在NCBI上對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Glb1和Glb2的片段在470 bp處缺失了一個(gè)堿基T，而35S1和35S2在85 bp處多了堿基G，在462 bp和463 bp處缺失了堿基A和T。因此，需進(jìn)行啟動(dòng)子功能驗(yàn)證，結(jié)果證明缺失或增加的堿基不在啟動(dòng)子的關(guān)鍵部位，不影響目的基因的正常表達(dá)，可以進(jìn)行下一步構(gòu)建。

圖4 Glb1及Glb2 PCR擴(kuò)增片段

圖5 35S1及35S2 PCR擴(kuò)增片段

2.3 表達(dá)載體pGlb1CB和p35SCB的構(gòu)建

經(jīng)雙酶切重組質(zhì)粒pEasy-T-Glb1，雙酶切質(zhì)粒pLtp1CB得到的含有Bperu/C1基因的大片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化和酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到中間載體pGlb1Ltp-1CB；再雙酶切質(zhì)粒pEasy-T-Glb2，與雙酶切質(zhì)粒pGlb1Ltp1CB得到的含有Bperu/C1基因的大片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化和酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到表達(dá)載體pGlb-1CB。同理，獲得了另一個(gè)表達(dá)載體p35SCB（圖6）。

圖6 重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證圖

2.4 表達(dá)載體的基因槍轉(zhuǎn)化瞬時(shí)表達(dá)

瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可以短暫而高水平地表達(dá)目的基因。將pGlb1CB載體（圖7-A）和p35SCB載體（圖7-B）轉(zhuǎn)入玉米幼胚的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明，

在48 h后該載體能夠正常表達(dá)，使部分玉米幼胚著彈部位細(xì)胞變成紫色。陽(yáng)性對(duì)照也表達(dá)紫色（圖7-C），陰性對(duì)照（圖7-D）和空白對(duì)照（圖7-E）不表達(dá)紫色。

圖7 表達(dá)載體的基因槍轉(zhuǎn)化瞬時(shí)表達(dá)

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，Glb1、Glb2擴(kuò)增片段在470 bp處缺失了一個(gè)堿基T后，仍可以調(diào)控花青素的表達(dá)，表明缺失堿基未影響啟動(dòng)子的功能。同理，CaMV-35S堿基序列缺失或增加均未影響啟動(dòng)子功能。個(gè)別堿基缺失后該啟動(dòng)子功能驗(yàn)證的觀察還未見(jiàn)報(bào)道，本研究的驗(yàn)證說(shuō)明構(gòu)建的啟動(dòng)子具有正常的胚特異性表達(dá)功能。然而，該啟動(dòng)子其它位點(diǎn)個(gè)別堿基的缺失對(duì)其功能影響的程度還有待進(jìn)一步研究。

不同植物的種子特異性啟動(dòng)子存在種間表達(dá)特異性及穩(wěn)定性的問(wèn)題［14］，如蠶豆USP基因啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中特異性表達(dá)，但在轉(zhuǎn)基因豌豆中，該啟動(dòng)子會(huì)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在花藥、花粉和種皮中都表達(dá)［15］；外源啟動(dòng)子在種子特異性啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度有時(shí)也會(huì)發(fā)生改變，如棉花的α-球蛋白啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草中驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)活性只是在棉花中表達(dá)量的16.7%和1%［16］，說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因研究中，利用植物本身的種子特異性啟動(dòng)子比較好。因而本試驗(yàn)用了Glb1代替Ltp1，為下一步轉(zhuǎn)化玉米做準(zhǔn)備。

載體pGlb1CB 可以使轉(zhuǎn)基因玉米的當(dāng)代和后代胚表現(xiàn)紫色而不影響植株的其它性狀，適合作標(biāo)記基因。載體p35SCB 以組成型強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)花青素表達(dá)，可以大大提高植物本身及果實(shí)中花青素的含量，改良植物品質(zhì)；提高人和動(dòng)物的攝入量，或者將玉米秸稈做成飼料喂養(yǎng)動(dòng)物，對(duì)動(dòng)物也存在諸多益處。因而，研究者可以根據(jù)試驗(yàn)需要及不同的研究目的選擇合適的載體。

將以上載體pGlb1CB和p35SCB用于植物轉(zhuǎn)基因研究，在轉(zhuǎn)化植株的當(dāng)代和后代中可以通過(guò)肉眼直接觀察到籽粒顏色變化的轉(zhuǎn)化籽粒，從而大大提高檢測(cè)效率，節(jié)省檢測(cè)成本。這類(lèi)標(biāo)記的廣泛使用將對(duì)植物轉(zhuǎn)基因研究具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究分別將玉米胚特異性啟動(dòng)子Glb1和組成型啟動(dòng)子CaMV35S與花青素調(diào)控因子C1/Bperu構(gòu)建成了植物轉(zhuǎn)化載體pGlb1CB和p35SCB，在玉米幼胚中的基因槍瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，玉米幼胚中彈部位細(xì)胞產(chǎn)生紫色，說(shuō)明載體pGlb1CB和p35SCB均能在植物細(xì)胞中正常表達(dá)。

致謝

感謝F. Eudes教授（Agriculture and Agri-Food Canada, Lethbridge Research Centre, Canada）提供pLtp1CB載體和M. P. Scott教授（Interdepartmental Genetics，Iowa State University，Iowa，USA）提供pGlb1G載體。感謝山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究中心張明義研究員和張艷琴副研究員為我們的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Vector Construction of Anthocyanins as a Visual Marker Gene and Its Transient Expression in Maize Immature Embryos

Zhao Xinmei1，2Wu Shubiao2Wang Yixue2Cui Guimei2Wang Xiaoqing2Du Jianzhong2Wang Xiaoli1，2Shang Yongjin2Sun Yi1，2，3
（1. Biological Engineering Institute，Shanxi University，Taiyuan 030006；2. Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031；3. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031）

Anthocyanin regulatory factor C1/Bperu genes are constructed respectively with a maize embryo specific promoter GLB1 and a constitutive promoter CaMV35S into plant transformation vectors pGlb1CB and p35SCB, and the recombinant expression vectors were introduced into maize embryos by particle bombardment. Microscopic observation confirmed that the two vectors were actively expressed in maize immature embryo cells. The use of anthocyanins as a marker gene not only could reduce the safety concerns from the public over GMO substantially, but could also be used as a visual indicator for the selection of transgenic plants, which could greatly simplify the screening procedures, improve the efficiency and reduce the costs.

Anthocyanins Visual marker Vector construction Transient expression Maize immature embryo

2013-10-11

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)（2013ZX08003-001），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31240081），山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20110311009），山西省財(cái)政支農(nóng)項(xiàng)目（2011NYGX-05）

趙欣梅，女，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：zxm880329@126.com

孫毅，男，博士，研究方向：植物基因工程和分子生物學(xué)研究；E-mail：sunyi692003@163.com