張獻賀 孔穩(wěn)穩(wěn) 李勇 李晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命利學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，哈爾濱 150030）

人工miRNA沉默基因的研究

張獻賀 孔穩(wěn)穩(wěn) 李勇 李晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命利學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，哈爾濱 150030）

人工miRNA（amiRNA）是一種高效的基因沉默技術(shù)，其原理是以植物內(nèi)源miRNA的前體為基本骨架，將其莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的miRNA/miRNA*序列替換為amiRNA/amiRNA*序列，使產(chǎn)生的amiRNA作用于目標靶基因，以實現(xiàn)對靶基因表達的抑制。以擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子基因MYB28為例，介紹了amiRNA的設(shè)計基本原理和構(gòu)建方法。在MYB28基因序列的3'端、5'端和中間部分分別設(shè)計了amiRNA，以擬南芥內(nèi)源的miRNA 319a前體為骨架，以靶向于MYB28的amiRNA序列替代原有的miRNA 319a序列，在擬南芥中過量表達，獲得的轉(zhuǎn)基因植株中MYB28表達水平平均降低了86%。根據(jù)試驗結(jié)果對人工miRNA沉默基因技術(shù)的特點及應(yīng)用前景進行了討論。

人工miRNA RNA干擾 擬南芥 基因沉默

RNA介導(dǎo)的基因沉默是真核生物調(diào)控基因表達和防御外源核酸入侵的重要機制。細胞中的雙鏈RNA（dsRNA）或具有較長發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA被雙鏈RNA特異性的RNA酶Dicer 剪切成21-24 nt的小干擾RNA片段（Small interfering RNA，siRNA），這些小RNA結(jié)合到以AGO蛋白為核心的RNA沉默復(fù)合體（RNA inducing silence complex，RISC）上，通過堿基的互補來實現(xiàn)對靶基因mRNA的剪切、抑制蛋白質(zhì)的翻譯或產(chǎn)生DNA水平的修飾［1］?；谶@一基本原理，多種植物基因沉默技術(shù)相繼建立起來，包括基于“共抑制”原理的基因沉默技術(shù)、反義RNA技術(shù)、發(fā)夾RNA干擾（hpRNAi）技術(shù)及病毒介導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)等［2］，這幾種基因沉默技術(shù)的共同點是通過引入的外源序列使細胞內(nèi)產(chǎn)生雙鏈RNA，從而引發(fā)RNA介導(dǎo)的基因沉默（圖1）。盡管這些方法都能實現(xiàn)對目的基因表達的抑制，但它們存在一個很大的弊端，即容易引起“脫靶效應(yīng)”，因為上述方法形成的雙鏈RNA經(jīng)過加工后會產(chǎn)生連續(xù)的多個小RNA，這些小RNA有很大幾率會作用于和靶序列具有同源性的非目標序列，造成非預(yù)期的“脫靶”現(xiàn)象［3］。

miRNA是一類長度為18-25 nt的內(nèi)源性非編碼

單鏈小RNA，與siRNA相比，其最本質(zhì)的特點是來源于一段具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體RNA，經(jīng)過DCL1等一系列酶的剪切與加工［4-6］最終形成一個成熟的miRNA，與沉默復(fù)合體RISC結(jié)合，通過堿基互補配對來實現(xiàn)對靶基因mRNA的剪切或抑制其翻譯［7-10］。

圖1 RNAi及amiRNA的基本原理

隨著miRNA調(diào)控基因表達的研究日益深入，利用人工miRNA（Artificial miRNA，amiRNA）沉默基因的技術(shù)逐步地建立起來［11-14］，其原理是以植物內(nèi)源miRNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體為基本骨架，將其莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的miRNA序列替換為可與目標靶基因mRNA部分互補的amiRNA序列，使產(chǎn)生的amiRNA作用于靶基因，以實現(xiàn)對靶基因表達的抑制。由于克服了以往的RNA干擾技術(shù)易脫靶的弱點，amiRNA不僅可以高效地沉默基因，同時具有很高的特異性。

為了驗證amiRNA基因沉默技術(shù)的有效性并對amiRNA的設(shè)計進行優(yōu)化，本研究以擬南芥中編碼轉(zhuǎn)錄因子的MYB28基因為目的基因，在基因編碼序列的3'端、5'端和中間部分分別設(shè)計了amiRNA，以擬南芥內(nèi)源的miRNA 319a前體為骨架，以設(shè)計的amiRNA序列替代原有的miRNA 319a序列作為amiRNA的前體，轉(zhuǎn)入擬南芥，成功抑制了MYB28基因的表達。根據(jù)試驗結(jié)果對amiRNA的設(shè)計、表達載體的構(gòu)建及應(yīng)用等進行了討論。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）生態(tài)型為Columbia（Col-0），種子萌發(fā)后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20℃，相對濕度70%，光照強度100 μmol/m2/s，光周期16/8 h/d。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株為Top10，農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株為LBA4404，植物表達載體為pCAMBIA230035Su，以上實驗材料均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 amiRNA的設(shè)計 為了使amiRNA 技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，Schwab等［11］開發(fā)了基于網(wǎng)頁的amiRNA 在線設(shè)計系統(tǒng)WMD（Web microRNA designer，http：// wmd3.weigelworld.org）。WMD系統(tǒng)參照植物物體內(nèi)自然miRNA的主要特點［15］，確定了amiRNA設(shè)計的一系列原則，根據(jù)已公布的轉(zhuǎn)錄本和EST數(shù)據(jù)庫，可為不同物種的已知mRNA、未做注釋的轉(zhuǎn)錄本及外源基因設(shè)計amiRNA。通過WMD3系統(tǒng)，我們針對MYB28的編碼序列進行了amiRNA的設(shè)計。在WMD3系統(tǒng)“Designer”窗口的“Target genes”框中輸入MYB28的序列編號：AT5G61420.1，選擇擬南芥的基因組數(shù)據(jù)庫，設(shè)計出一系列候選的amiRNA序列，從中選取得分較高的、分別靶向于MYB28編碼序列3'端、5'端和中間部分的amiRNA，分別命名為amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3（序列和分析見2.1）進行后續(xù)試驗。

amiRNA前體序列采用擬南芥miRNA319a前體為基本骨架，miRNA319a前體序列從mirbase數(shù)據(jù)庫（http：//www.mirbase.org）［16］獲得，將miRNA319a/ miRNA319a*分 別 替 換 為amiRNA1/amiRNA1*，amiRNA2/amiRNA2*和amiRNA3/amiRNA3*，得到的3個amiRNA前體序列，長度均為370 bp，由南

京金斯瑞生物科技有限公司合成獲得。

1.2.2 amiRNA前體的克隆及植物表達載體的構(gòu)建 將植物表達載體pCAMBIA2300參照Nour-Eldin等［17］的方法進行改造，使其成為具有萬能接頭的植物表達載體pCAMBIA230035Su，在amiRNA前體的兩側(cè)設(shè)計一對引物5'-ggcttaaUGCAGCCCCAAACACACG-3'和 5'-ggtttaaUTGTCACTTAGTGGATCAAGC ATG-3'分別以人工合成的3個amiRNA前體DNA為模板，將PCR擴增獲得的amiRNA1、amiRNA2和amiRNA3前體分別連入pCAMBIA230035Su，獲得由組成型啟動子35S驅(qū)動的過量表達amiRNA的植物表達載體，35S∷amiRNA1，35S∷amiRNA2和35S∷amiRNA3（圖2）。

圖2 35S：amiRNA植物表達載體構(gòu)建示意圖

1.2.3 外源基因轉(zhuǎn)化擬南芥及轉(zhuǎn)基因植株的篩選 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法［18］將構(gòu)建好的3個植物表達載體分別轉(zhuǎn)入Col-0生態(tài)型擬南芥中，T0代種子播種在含有50 mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，篩選抗性植株。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測 將卡那霉素篩選獲得的抗性植株在四葉期時移栽到由蛭石與黑土1∶1的混合土中，一段時間后取擬南芥T1代抗性植株葉片，用DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取基因組DNA。根據(jù)3個amiRNA的序列設(shè)計特異的上游檢測引物，根據(jù)載體上的序列設(shè)計下游引物（序列見表1的amiRNA1，amiRNA2，amiRNA3），進行PCR檢測，確定抗性苗中amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3是否整合入基因組中。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株中amiRNA表達水平的檢測 用RNA提取試劑盒（Easy Pure Plant RNA Kit）分別提取野生型和PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株葉片總RNA，采用BioTeke supermoⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligodT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板擴增內(nèi)參基因ACTIN2，將所有樣品的RNA調(diào)節(jié)至相同濃度，用于后續(xù)RT-PCR分析。由于成熟miRNA的長度僅為20 nt左右，無法用常規(guī)RT-PCR進行檢測，amiRNA表達水平的檢測參照Varkonyi-Gasic等［19］的Stemloop RT-PCR 法，根據(jù)amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3的序列分別設(shè)計了莖環(huán)引物 Stemloop RT-1，Stemloop RT-2和 Stemloop RT-3（序列見表1）對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后用引物amiRNA1RT，amiRNA2RT和amiRNA3RT（序列見表1）對成熟amiRNA的表達量進行RT-PCR分析。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株中amiRNA對靶基因MYB28的影

響 用RNA提取試劑盒分別提取野生型和PCR陽性擬南芥葉片總RNA，以O(shè)ligodT為引物合成cDNA的第一條鏈，并以此為模板來進行半定量PCR檢測MYB28的表達水平，引物設(shè)計在amiRNA剪切位點的兩側(cè)（引物序列見表1）。同時對MYB28調(diào)控的下游基因脂肪族芥子油苷側(cè)鏈延長酶基因BCAT4，MAM1和中心結(jié)構(gòu)合成酶基因CYP79F1的表達水平也進行了分析。

表1 PCR檢測引物序列

為了定量分析MYB28表達水平的變化，對MYB28進行了實時熒光定量PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）（引物見表1），以ACTIN2為內(nèi)參基因。實時熒光定量PCR采用比較CT法（ΔΔCT），以野生型擬南芥作為參照因子，通過2-ΔΔCT方法計算，每個基因做3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值［20］。

2 結(jié)果

2.1 amiRNA序列的確定

通過WMD3系統(tǒng)，獲得了靶向于MYB28基因序列的一系列amiRNA序列，WMD3系統(tǒng)根據(jù)amiRNA設(shè)計的多項參數(shù)標準對所設(shè)計的序列進行了評價，我們按照這些amiRNA的優(yōu)劣順序選擇了3個分別靶向于MYB28序列3'端、5'端和中間區(qū)域的amiRNA，以確定amiRNA的效率是否與結(jié)合位點有關(guān)，分別命名為amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3，三者與MYB28 基因的結(jié)合及剪切位點如圖3，3個amiRNA的序列見圖4。

圖3 三個不同的amiRNA與靶基因的結(jié)合部位及剪切位點

所選的3個amiRNA符合如下條件：在2-12位只有一個錯配，10-11位是剪切位點沒有錯配，13位后的區(qū)域沒有連續(xù)錯配，在3'端引入了一個錯配。3個amiRNA前體均以miR319a前體為基本骨架，包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)兩端一定長度的側(cè)翼序列，將miR319a分別替換為amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3，前體的總長度為370 bp，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成完整的amiRNA前體序列。

圖4 miR319a及amiRNA前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)的部分序列

2.2 amiRNA前體序列的克隆與載體構(gòu)建

以人工合成的3個amiRNA前體DNA為模板，以amiRNA前體兩側(cè)序列為引物擴增出目標片段，長度在370 bp左右（圖5）。將PCR擴增獲得的amiRNA1、amiRNA2和amiRNA3前體分別連入pCAMBIA230035Su，獲得由組成型啟動子35S驅(qū)動的過量表達amiRNA的植物表達載體。將獲得的植物表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，挑取陽性菌落進行測序，結(jié)果顯示插入序列與設(shè)計的序列一致。

圖5 amiRNA前體的PCR擴增

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將構(gòu)建好的植物表達載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，隨機選取amiRNA1、amiRNA2、amiRNA3轉(zhuǎn)基因植株中具有卡那霉素抗性的植株進行PCR檢測，預(yù)期的擴增長度為700 bp，以野生型擬南芥為陰性對照，圖6是部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果，9株轉(zhuǎn)基因植株中有7株檢測出了預(yù)期的700 bp左右的特異條帶，說明amiRNA前體已經(jīng)成功地整合至擬南芥的基因組中。

圖6 部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

2.4 轉(zhuǎn)基因植株中amiRNA表達水平的檢測

為了檢測轉(zhuǎn)基因植株中是否具有amiRNA（成熟體）的過量表達，本試驗對野生型和PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因擬南芥隨機取樣進行了半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明，3種amiRNA在野生型植株均沒有表達，而在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)入的amiRNA均有明顯的表達。說明amiRNA1，amiRNA2和amiRNA3的前體轉(zhuǎn)入擬南芥后可被成功地加工形成成熟的amiRNA。

圖7 轉(zhuǎn)基因植株中amiRNA表達水平的分析

2.5 amiRNA對靶基因沉默效應(yīng)的檢測

為了檢測amiRNA對靶基因的沉默效率，對35S∷amiRNA1，35S∷amiRNA2和 35S∷amiRNA3植株中MYB28的表達水平進行了半定量RT-PCR分析，結(jié)果（圖8）顯示轉(zhuǎn)基因植株中MYB28的表達量與野生型相比顯著降低。然后通過實時熒光定量PCR進一步對MYB28基因進行定量分析，如圖9所示，作用于MYB28基因3'端的35S∷amiRNA1中MYB28的相對表達量平均下降了88%，作用于中間區(qū)域的35S∷amiRNA3中MYB28的相對表達量平均下降了86%，作用于MYB28基因5'端的35S∷amiRNA2中MYB28的相對表達量平均下降了84%，說明3個amiRNA在轉(zhuǎn)基因擬南芥中都可以有效地沉默靶基因MYB28，且靶向于不同位置的amiRNA沉默效率沒有明顯區(qū)別。此外，對MYB28調(diào)控的下游基因進行半定量PCR檢測，結(jié)果表明（圖8），3種不同的轉(zhuǎn)基因植株中，MYB28調(diào)控的下游基因表達水平均顯著降低，證明amiRNA有效地抑制了靶基因MYB28的表達，導(dǎo)致其調(diào)控的下游基因表達水平也明顯降低。

3 討論

基因功能缺失突變體是研究基因功能不可缺少的材料。本研究以擬南芥miRNA319a前體為基本骨架設(shè)計了3個amiRNA，均成功地抑制了擬南芥轉(zhuǎn)錄因子MYB28基因的表達，獲得了通過商業(yè)渠道無法得到的myb28缺失突變體，有利地證明了amiRNA介導(dǎo)基因沉默的有效性。根據(jù)本試驗結(jié)果，目的基因雖不能被amiRNA完全敲除，但表達水平比野生型降低了86%，這種顯著的抑制作用對研究基因功能也是有益的。T-DNA插入獲得的突變體往往可以導(dǎo)致基因功能的全部喪失，但對于純合突變體致死的基因則很難應(yīng)用，利用amiRNA對這些基因進行抑制則有可能解決這個問題。

圖8 amiRNA對MYB28及其下游基因表達的影響

圖9 35S∷amiRNA1，35S∷amiRNA2和35S∷amiRNA 3對MYB28沉默效應(yīng)的比較

與其他RNAi基因沉默技術(shù)相比，amiRNA有其獨特之處。由于amiRNA前體會形成一個長度適當?shù)那o環(huán)結(jié)構(gòu)，最終只生成一個amiRNA，對靶基因有很好的特異性，脫靶率大大降低。此外，由于amiRNA與靶基因的結(jié)合位點通常有幾個堿基的錯配，因而可以對多個序列相似的基因（如一個家族的基因成員）同時產(chǎn)生沉默效應(yīng)［21］。因而，利用amiRNA沉默基因不僅具有精準性，同時還具有高效性。

由于生物內(nèi)源的miRNA通常會結(jié)合在靶基因的

3'端，在目的基因序列已知的情況下，amiRNA通常被設(shè)計在3'端。我們的研究表明，結(jié)合于MYB28基因3'端、5'端和中間位置的amiRNA均可有效抑制基因的表達，且三者沒有顯著差別，因而amiRNA可能不存在位置效應(yīng)。由于amiRNA與靶基因的結(jié)合區(qū)域只有20幾個堿基，且沒有明顯的位置效應(yīng)，因此對于一些序列不完全清楚或只有EST的基因，也可以設(shè)計amiRNA來實現(xiàn)基因的沉默。

以擬南芥miRNA前體為基本骨架設(shè)計的amiRNA不僅成功地應(yīng)用于擬南芥的基因沉默，目前也已經(jīng)成功地應(yīng)用于番茄和煙草的基因沉默［22-25］，盡管目前還無法證明在其他植物中的有效性，但至少說明miRNA的前體具有一定的保守性，在其他植物（尤其是缺乏試驗驗證miRNA的物種）中應(yīng)用基于擬南芥miRNA前體的amiRNA具有可行性。對于那些自身具有經(jīng)試驗驗證的miRNA的植物，以自身的miRNA前體為基本骨架設(shè)計amiRNA則為更好的選擇。

鑒于amiRNA的精準性、高效性及應(yīng)用的廣泛性，amiRNA介導(dǎo)的基因沉默已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于基因功能的研究或?qū)?jīng)濟植物進行遺傳改良。目前，WMD為amiRNA的設(shè)計與應(yīng)用提供的平臺也日趨完善，不論模式植物還是遺傳背景數(shù)據(jù)不十分完善的非模式植物，均可借助WMD實現(xiàn)amiRNA的設(shè)計及后續(xù)克隆和遺傳轉(zhuǎn)化方案的優(yōu)化，這使amiRNA基因沉默技術(shù)變得更加簡便可行，隨著miRNA前體加工機制研究的進一步深入，amiRNA沉默技術(shù)的應(yīng)用將會得到進一步拓展，必將在生物學(xué)研究中會發(fā)揮更大的作用。

4 結(jié)論

本研究以MYB28為靶基因，利用amiRNA沉默技術(shù)在MYB28基因序列的3'端、5'端和中間部分分別設(shè)計了1個amiRNA，導(dǎo)入擬南芥后利用Realtime PCR方法分別分析了轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中MYB28的相對表達量。結(jié)果表明作用于MYB28基因3'端的amiRNA1轉(zhuǎn)基因植株中MYB28的相對表達量平均降了88%，作用于中間區(qū)域的amiRNA3轉(zhuǎn)基因植株中MYB28的相對表達量平均下降了86%，作用于MYB28基因5'端的amiRNA2轉(zhuǎn)基因植株中MYB28的相對表達量平均下降了84%，說明3個amiRNA在轉(zhuǎn)基因擬南芥中都可以有效地沉默靶基因。

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（責任編輯 狄艷紅）

Study of Gene Silencing by Artificial miRNA

Zhang Xianhe Kong Wenwen Li Yong Li Jing
（Key Laboratory of Agriculatural Biological Functional Genes，College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

Artificial miRNA（amiRNA）is an effective gene silencing technology. The basic principle of amiRNA is based on its biogenesis mechanism. Using endogenous miRNA precursor as a basic framework, miRNA/miRNA* is then replaced by amiRNA/amiRNA*. The produced amiRNA is expected to silence the target gene. In this paper, the basic principle and method of amiRNA construction was introduced. AmiRNAs were designed to the target gene MYB28 as an example. Three amiRNAs respectively target to the 3' terminal region, 5' region and middle region of MYB28 coding sequence were designed. Precursor of miRNA 319a in Arabidopsis thaliana was taken as a framework and miRNA319a sequence was replaced by amiRNAs targeting to MYB28 gene. The expression level of MYB28 in transgenic plants decreased 86%. Based on our experiments, the unique characteristics of amiRNA and its further applications were discussed.

Artificial miRNA RNAi Arabidopsis thaliana Gene silencing

2013-11-08

國家自然科學(xué)基金項目（31070265）

張獻賀，男，碩士研究生，研究方向：植物生物工程；E-mail：xhzhang8888@sina.cn

李晶，女，博士，教授，研究方向：植物生物工程；E-mail：lijing@neau.edu.cn