蔡珊珊徐勝勇宋 娜高天翔張朝暉

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所, 青島 266003; 2. 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061)

黃鯽線粒體DNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)及長度多態(tài)性分析

蔡珊珊1徐勝勇1宋 娜1高天翔1張朝暉2

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所, 青島 266003; 2. 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061)

魚類線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)因?yàn)榫哂薪Y(jié)構(gòu)簡單、嚴(yán)格的母系遺傳、缺少重組等特點(diǎn)而成為重要的分子標(biāo)記[1—4]。線粒體DNA控制區(qū)(Control region, CR, 又稱D-loop區(qū))是一段非編碼區(qū), 進(jìn)化速率快, 容易積累較多的變異(如堿基的替換、插入和缺失等), 被廣泛應(yīng)用于種內(nèi)分子遺傳學(xué)研究[5—7]?？刂茀^(qū)一般分為終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)3部分。控制區(qū)變異多發(fā)生于終止序列區(qū), 中央保守區(qū)和保守序列區(qū)相對(duì)保守,且存在多個(gè)保守片段(CSB-F、CSB-E、CSB-D、CSB-1、CSB-2、CSB-3等)[7]。目前已分析研究了多種魚類的線粒體DNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)[7—15], 并總結(jié)歸納出控制區(qū)各保守片段的普遍形式[7]。在部分魚類線粒體DNA控制區(qū)中亦發(fā)現(xiàn)長度多態(tài)性現(xiàn)象[7,14,15], 控制區(qū)長度多態(tài)性可能應(yīng)用于種內(nèi)或種間群體學(xué)研究[16]。

黃鯽(Setipinna tenuifilis)隸屬鯡形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulididae)、黃鯽屬, 廣泛分布于印度洋西部和西北太平洋海域, 中國沿海各海域均有分布。黃鯽為近海中下層魚類, 喜棲息于泥沙底、水流較緩的海區(qū)[17,18]。黃鯽是一種小型經(jīng)濟(jì)魚類。20世紀(jì)80年代以來, 隨著小黃魚、藍(lán)點(diǎn)馬鮫、帶魚等傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)魚類資源量下降, 黃鯽的捕獲量逐年增加[18]。由于捕撈壓力過大, 黃鯽資源量已呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[19—21]。目前對(duì)黃鯽的研究主要集中在時(shí)空分布、種群結(jié)構(gòu)和生物學(xué)等方面[18—22]。Li等[23]和張博[24]對(duì)黃鯽控制區(qū)序列進(jìn)行分析研究, 識(shí)別了CSB-F、CSB-E、CSB-D、CSB-1、CSB-2、CSB-3, 并在終止序列區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列現(xiàn)象。本研究在分析黃鯽線粒體DNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上, 對(duì)控制區(qū)長度多態(tài)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 以期為黃鯽群體遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ), 同時(shí)探討重復(fù)序列應(yīng)用于黃鯽群體遺傳學(xué)分析的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用黃鯽樣品于2005—2013年采自中國沿海7個(gè)地點(diǎn)(東營、煙臺(tái)、青島、南通、溫州、廈門、北部灣), 共202尾個(gè)體(表1)。在實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后, 取小塊肌肉組織于 95%酒精溶液中固定, 置于–20℃冰箱中保存待用。

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

取肌肉組織約100 mg經(jīng)蛋白酶K消化后, 使用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法抽提獲得線粒體基因組DNA。使用100 mL去離子水溶解線粒體基因組 DNA, 置于–4℃冰箱中保存待用。每個(gè)群體取5尾個(gè)體擴(kuò)增控制區(qū)全序列用于控制區(qū)結(jié)構(gòu)分析, 其他個(gè)體僅擴(kuò)增控制區(qū)高變區(qū)(Hypervariable region I)用于長度多態(tài)性分析。

表1 黃鯽樣品信息Tab. 1 Sample information of Setipinna tenuifilis

黃鯽控制區(qū)全序列擴(kuò)增分兩段測序, 其中控制區(qū)高變區(qū)引物[25]為: HJF: 5′-CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA-3′; HJR: 5′-GGAACACCGAGTAATGCTGAG-3′; 控制區(qū)后半段引物為: HJHF: 5′-CATTTTCTATGCGTTCCTCAG-3′; HJHR: 5′-GTGCGGATACTTGCATGTGT-3′。

PCR反應(yīng)體系為25 μL, 其中Taq酶0.25 μL, DNA模板1 μL, 正、反向引物各1 μL, dNTP 2 μL, 10×PCR buffer 2.5 μL, 去離子水17.25 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min; 94℃變性45s, 52℃退火45s, 72℃延伸45s, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(U = 300 V), 使用回收試劑盒(上海沃森生物科技公司)對(duì)目的條帶進(jìn)行回收純化, 使用 ABI Prism 3730型DNA序列分析儀對(duì)回收純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行正反鏈測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用 DNASTAR軟件包(DNASTAR, Inc., Madison, USA)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)、編輯和分析, 并對(duì)結(jié)果輔以人工校正; 使用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)重復(fù)序列頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析; 使用RNAstructure 4.3軟件[26]分析重復(fù)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)并計(jì)算其釋放的自由能; 使用SPSS 18.0軟件對(duì)重復(fù)序列頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(Chi-square test), 以計(jì)算兩兩群體間重復(fù)序列頻率的差異顯著性。

按照Birky等[27]的理論, 計(jì)算不同層次遺傳多樣性。由于黃鯽控制區(qū)DNA不存在個(gè)體內(nèi)異質(zhì)性現(xiàn)象, 個(gè)體內(nèi)遺傳多樣性 Kb= 0; 群體內(nèi)個(gè)體間遺傳多樣性 Kc= 1–ΣXi2, Xi指某一DNA類型(長度差異)在群體內(nèi)的頻率; 總體遺傳多樣性Kt= 1–ΣYi2, Yi指某一DNA類型(長度差異)在所有個(gè)體內(nèi)的頻率。根據(jù)公式Cip= (mean Kc–Kb)/Kt和Cpt= (Kt–mean Kc)/Kt計(jì)算遺傳差異在群體內(nèi)和群體間所占比例[28]。

2 結(jié)果

2.1 控制區(qū)序列長度和堿基組成

對(duì)黃鯽控制區(qū)序列進(jìn)行編輯和人工校正后, 得到黃鯽全序列長度為1193—1271 bp。35條序列共定義了6個(gè)單倍型, 檢測到9個(gè)變異位點(diǎn), 其中9個(gè)位點(diǎn)均為轉(zhuǎn)換。以CSB-F起始位置和CSB-1起始位置分別為終止序列區(qū)和中央保守區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)的界線, 8個(gè)變異位點(diǎn)位于終止序列區(qū)內(nèi), 1個(gè)變異位點(diǎn)位于中央保守區(qū),在保守序列區(qū)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)。同時(shí), 在終止序列區(qū)內(nèi)(165—437 bp)檢測到串聯(lián)重復(fù)序列(Tandem repeat sequence)結(jié)構(gòu), 重復(fù)序列單元長度為 39 bp, 重復(fù)次數(shù)為 5—7次。重復(fù)序列現(xiàn)象僅存在于個(gè)體間, 并沒有發(fā)現(xiàn)個(gè)體內(nèi)異質(zhì)性(Heterogeneous)現(xiàn)象。

以長度為1271 bp的控制區(qū)序列為例分析序列中堿基A、T、G、C的含量(表2)?？刂茀^(qū)全序列A+T含量(64.9%)高于 C+G含量, 這一結(jié)果與其他魚類控制區(qū)堿基組成相似。重復(fù)序列單元 A+T含量(79.5%)均高于全序列含量(64.9%)、終止序列區(qū)含量(72.4%)、中央保守區(qū)含量(57.1%)和保守序列區(qū)(55.9%)。

表2 黃鯽控制區(qū)序列堿基組成及長度Tab. 2 Nucleotide compositions and length of mitochondrial DNA control region of S. tenuifilis

2.2 終止序列區(qū)

終止序列區(qū)是控制區(qū)內(nèi)變異最多的區(qū)域。黃鯽控制區(qū)終止序列區(qū)長度為592—670 bp, 在終止序列區(qū)前端發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列。參考鱭屬魚類線粒體DNA控制區(qū)擴(kuò)展終止相關(guān)序列(Extended termination associated sequence, ETAS)特征序列[9]和 鲿科魚類ETAS特征序列[13], 確定黃鯽控制區(qū)ETAS特征序列為TACAT ACTATGCATTATATT ACAT, 與劉煥章[7]對(duì)ETAS的描述略有不同, 與Li等[23]的研究結(jié)果相似(圖 1), 且 ETAS包含在串聯(lián)重復(fù)單元中,黃鯽控制區(qū)終止序列區(qū)內(nèi)存在5—7個(gè)ETAS。

圖1 黃鯽控制區(qū)終止序列區(qū)序列Fig. 1 Termination associated sequence of S. tenuifilis

2.3 中央保守區(qū)

中央保守區(qū)內(nèi)含有多個(gè)保守序列。參照劉煥章[7]給出的 魚類中央保守區(qū)D、E、F 3個(gè)保守片段的特征序列及鱭屬魚類中央保守區(qū)D、E、F 3個(gè)保守片段的特征序列[9], 在黃鯽控制區(qū)中央保守區(qū)內(nèi)共識(shí)別出CSB-D、CSB-E、CSB-F 3個(gè)保守序列。其中CSB-F序列為ATGTAG TA AGAAACCACC, CSB-E序列為AGGG ACAACTATTGTGGGGGACTG GCATCTG , CSB-D 序列為 TATT

GT, 與Li等[23]的研究結(jié)果相似(圖2)。CSB-E序列中發(fā)現(xiàn) GTGGG-box, 且與鱭屬魚類 CSB-E序列相同, 其他2個(gè)序列與鱭屬魚類特征序列分別存在1個(gè)堿基差異[9]。

2.4 保守序列區(qū)

參照鱭屬魚類的CSB-1、CSB-2和CSB-3的特征序列, 我們識(shí)別出黃鯽的3個(gè)保守序列區(qū)片段。CSB-1的序列為TTGATAGAAGAATTGCATAA; CSB-2和CSB-3的序列分別為AAACCCCCTTACCCCC和TGTCAAACCCC GAAA, 與Li等[23]的研究結(jié)果相似(圖2)。

圖2 黃鯽控制區(qū)中央保守區(qū)和保守序列區(qū)序列Fig. 2 Central conserved domain and conserved sequence block sequence of S. tenuifilis

2.5 重復(fù)序列

對(duì)202尾黃鯽個(gè)體的控制區(qū)高變區(qū)序列進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳(U = 100V), 發(fā)現(xiàn)個(gè)體間存在長度多態(tài)性現(xiàn)象(圖 3)。對(duì)黃鯽控制區(qū)高變區(qū)序列進(jìn)行正反鏈測序, 測序結(jié)果顯示黃鯽控制區(qū)高變區(qū)存在長度為39 bp的重復(fù)序列單元, 重復(fù)次數(shù)為 5—7次。結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳圖及測序結(jié)果, 統(tǒng)計(jì)黃鯽控制區(qū)重復(fù)序列單元頻率, 結(jié)果顯示 6次重復(fù)的個(gè)體最多, 其次為7次重復(fù)個(gè)體, 5次重復(fù)個(gè)體最少, 僅出現(xiàn)在東營、煙臺(tái)、南通和溫州群體內(nèi); 北部灣群體內(nèi)7次重復(fù)個(gè)體較多, 其他6個(gè)群體均為6次重復(fù)個(gè)體比例較大(圖4)。在重復(fù)序列頻率上, 卡方檢驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示北部灣群體與其他 6個(gè)群體存在極顯著的差異(χ2＞16.655, P=0.000), 其他各群體間差異不顯著(χ2＜2.945, P ＞ 0.229)。

使用RNAstructure軟件分析、構(gòu)建重復(fù)序列二級(jí)結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列能夠形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)并釋放一定的自由能(圖5), 5次重復(fù)序列釋放的自由能為–24.2 kcal/M; 6次重復(fù)序列釋放的自由能為–28.7 kcal/M; 7次重復(fù)序列釋放的自由能為–34.2 kcal/M。隨著重復(fù)次數(shù)的增加, 重復(fù)序列形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)越來越穩(wěn)定, 釋放的自由能也越來越高。

對(duì)黃鯽控制區(qū)重復(fù)序列遺傳多樣性和群體遺傳差異進(jìn)行分析比較, 結(jié)果顯示 7個(gè)群體遺傳多樣性(Kc)為0.255—0.423, 平均為 0.347; 所有個(gè)體遺傳多樣性為0.435。79.77%的遺傳差異來自群體內(nèi)個(gè)體間, 而20.23%的遺傳差異來自群體間(表4)。

圖3 黃鯽控制區(qū)高變區(qū)長度多態(tài)性(以東營群體為例)Fig. 3 Length polymorphism in hypervariable region I of S. tenuifilis in population Dongying

表3 兩兩群體間卡方檢驗(yàn)結(jié)果(對(duì)角線下側(cè)為χ2值, 對(duì)角線上側(cè)為P值)Tab. 3 Pairwise χ2(below diagonal) and P values (above diagonal) among S. tenuifilis populaitons

圖4 黃鯽7個(gè)群體重復(fù)序列頻率Fig. 4 Frequency of tandem repeat sequence in seven populations of S. tenuifilis

表4 黃鯽群體重復(fù)序列遺傳多樣性和遺傳差異分析結(jié)果Tab. 4 Results of genetic diversity and genetic differentiation of seven populations of S. tenuifilis

3 討論

3.1 黃鯽控制區(qū)結(jié)構(gòu)

黃鯽控制區(qū)結(jié)構(gòu)與其他海洋魚類相似, 通過比對(duì)其他魚類的控制區(qū)結(jié)構(gòu), 我們發(fā)現(xiàn)在黃鯽控制區(qū)終止序列區(qū)內(nèi)存在5—7個(gè)擴(kuò)展終止相關(guān)序列(ETAS), 這一重復(fù)片段也是造成黃鯽控制區(qū)長度多態(tài)性的主要原因。同時(shí), 在中央保守區(qū)和保守序列區(qū)內(nèi)分別識(shí)別6個(gè)保守序列(CSBD—F和CSB-1—3)。

終止序列區(qū)是魚類控制區(qū)內(nèi)變異積累最多的區(qū)域,重復(fù)序列也多發(fā)生在終止序列區(qū)。朱世華等[13]發(fā)現(xiàn)在康氏似 鲹(Scomberoides commersonianus)的控制區(qū)終止序列區(qū)內(nèi)存在串聯(lián)重復(fù)序列, 在中華鱘[14](Acipenser sinensis)、高首鱘[29](Acipenser transmontanus)控制區(qū)終止序列區(qū)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列, 且在康氏似 鲹和高首鱘控制區(qū)內(nèi)存在多個(gè) TAS。黃鯽控制區(qū)結(jié)構(gòu)分析的研究中, 張博[24]在終止序列區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)5個(gè)ETAS, Li等[23]發(fā)現(xiàn)7個(gè)ETAS。本研究中, 黃鯽控制區(qū)ETAS出現(xiàn)頻率為5—7次, 呈現(xiàn)個(gè)體間長度多態(tài)性。

中央保守區(qū)是整個(gè)控制區(qū)中最為保守的區(qū)域[30],Southern等[31]識(shí)別出哺乳動(dòng)物中央保守區(qū)B、C、D、E、F 5個(gè)保守序列; Randi和Lucchini[32]識(shí)別了鳥類中央保守區(qū)C、D、E、F 4個(gè)保守序列。但在多種魚類[7—13]中僅識(shí)別3個(gè)保守片段(CSB-D、E、F)。對(duì)黃鯽的中央保守區(qū)進(jìn)行分析, 也僅識(shí)別了 CSB-D、E、F等保守片段, 并沒有發(fā)現(xiàn)CSB-B和CSB-C序列。

圖5 重復(fù)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)及自由能Fig. 5 Predicted secondary structure and free energy of tandem repeat sequences

保守序列區(qū)可能是控制區(qū)中最為重要的區(qū)域, 其包含有H鏈復(fù)制起始區(qū)(OH)、H鏈啟動(dòng)子(HSP)、L鏈啟動(dòng)子(LSP)和 3個(gè)保守片段(CSB-1—3)等多個(gè)功能區(qū)域[30],其中 CSB-1是區(qū)分中央保守區(qū)和保守序列區(qū)的標(biāo)志, 其變異較大, 而 CSB-2和 CSB-3相對(duì)保守[7]?，F(xiàn)已識(shí)別出多種魚類保守序列區(qū)的保守片段并給出各保守片段的一般形式[7—15]。在黃鯽保守序列區(qū)內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)CSB-1的特征序列(GACATA), 參照鱭屬魚類等的CSB-1特征序列,我們發(fā)現(xiàn)黃鯽的CSB-1序列為TTGATAGAAGAATTGC ATAA。CSB-2和CSB-3序列相對(duì)保守。

3.2 黃鯽控制區(qū)重復(fù)序列

黃鯽控制區(qū)終止序列區(qū)出現(xiàn)多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列, 且個(gè)體間重復(fù)次數(shù)不同。串聯(lián)重復(fù)序列形成機(jī)制較多, 如重組(Recombination)和轉(zhuǎn)座(Transposition)[16]、不等交換(Unequal crossing over)或基因轉(zhuǎn)換(Gene conversion)[33]、滑鏈(Strand slippage)[34]等。由于脊椎動(dòng)物線粒體DNA中一般不發(fā)生重組現(xiàn)象[35], 滑鏈錯(cuò)配(Slipped-strand mispairing)是最有可能形成串聯(lián)重復(fù)序列的機(jī)制。這一機(jī)制在核基因中也同樣存在[36,37]。目前仍需要深入研究以確定決定重復(fù)次數(shù)頻率的機(jī)制。

重復(fù)序列頻率差異可能應(yīng)用于群體比較和種類鑒別。Stepien等[38]對(duì)梅花鱸(Gymnocephalus cernua)重復(fù)序列多態(tài)性進(jìn)行分析研究, 發(fā)現(xiàn)梅花鱸各地理群體間重復(fù)序列頻率差異顯著; Broughton和 Dowling[39]對(duì)斑鰭真小鯉(Cyprinella spiloptera)重復(fù)序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 發(fā)現(xiàn)其地理群體間重復(fù)序列頻率存在顯著差異; Cesaroni等[40]對(duì)2個(gè)群體的歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)的線粒體重復(fù)序列進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列頻率能夠較好的將 2個(gè)群體區(qū)分開; 但Miracle和Campton[41]對(duì)尖吻鱘(Acipenser oxyrhynchus desotoi)的線粒體重復(fù)序列進(jìn)行分析, 沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列頻率與地理分布存在相關(guān)性。Li等[23]利用線粒體DNA控制區(qū)序列對(duì)中國近海5個(gè)黃鯽群體進(jìn)行遺傳學(xué)分析, 結(jié)果顯示東海海域與黃海海域黃鯽群體間不存在顯著的遺傳差異; 張博[24]利用微衛(wèi)星標(biāo)記方法對(duì)中國近海5個(gè)黃鯽群體進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)東海海域與黃海海域黃鯽群體間存在顯著的遺傳分化; Xu等[25]利用線粒體 DNA控制區(qū)序列對(duì)中國近海 7個(gè)黃鯽群體進(jìn)行遺傳學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)中國沿海黃鯽群體可分為黃渤海組群、東海組群和南海組群, 各組群間存在較大的遺傳差異。在本研究中, 對(duì)黃鯽控制區(qū)重復(fù)序列頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示北部灣群體與其他 6個(gè)群體間差異極顯著, 這一結(jié)果與Xu等[25]的研究結(jié)果相似, 佐證了南海組群與其他組群存在遺傳差異, 但并未發(fā)現(xiàn)東海海域群體與黃渤海海域群體間的遺傳差異。僅通過重復(fù)序列頻率不能將北部灣群體與其他群體完全區(qū)分, 重復(fù)序列頻率可能作為一種補(bǔ)充和輔助手段用于群體遺傳學(xué)研究。

致謝:

感謝孫典榮研究員、李龍、李淵為本研究采集黃鯽樣品！

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MITOCHONDRIAL DNA CONTROL REGION STRUCTURE AND LENGTH POLYMORPHISM ANALYSIS OF SETIPINNA TENUIFILIS

CAI Shan-Shan1, XU Sheng-Yong1, SONG Na1, GAO Tian-Xiang1and ZHANG Zhao-Hui2
(1. Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. The First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 266061, China)

黃鯽; 控制區(qū); 結(jié)構(gòu); 串聯(lián)重復(fù)序列; 長度多態(tài)性

Setipinna tenuifilis; control region; Structure; Tandem repeat sequence; Length polymorphism

Q346+.5

A

1000-3207(2014)05-0980-07

2014-04-09;

2014-06-13

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201305030, 201405010); 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(201262022)資助

蔡珊珊(1990—), 女, 山東濰坊人, 碩士研究生, 主要從事漁業(yè)生態(tài)學(xué)研究。E-mail: cssrsjzdw110@163.com

張朝暉(1970—), 男, 副研究員; E-mail: zhang@fio.org.cn