蘆亞菲曲 娜陳曉波匡廷云

(1. 河北科技大學生物科學與工程學院, 石家莊 050018; 2. 中國科學院植物研究所, 光生物學重點實驗室, 北京 100093)

一種快速構(gòu)建集胞藻6803 petBD必需基因定點突變株的方法

蘆亞菲1曲 娜1陳曉波1匡廷云2

(1. 河北科技大學生物科學與工程學院, 石家莊 050018; 2. 中國科學院植物研究所, 光生物學重點實驗室, 北京 100093)

集胞藻6803(Synechocystis sp. Strain PCC 6803)是能夠進行光合自養(yǎng)的原核生物, 因其遺傳背景清楚, 特別是它具有天然的同源重組轉(zhuǎn)化能力, 是研究光合作用的模式生物之一[1—3]。以集胞藻進行分子生物學研究, 最常用的方法是基因敲除, 即基于同源重組原理, 利用抗生素的抗性基因插入到目的基因內(nèi)部, 使其功能喪失[4]; 如進行定點突變常規(guī)的方法是首先構(gòu)建一個缺失質(zhì)粒, 通過同源重組缺失目的基因的部分片段; 然后再構(gòu)建一個回復(fù)突變質(zhì)粒, 在回復(fù)質(zhì)粒內(nèi)部設(shè)計突變位點, 利用同源重組把缺失的基因片段(已經(jīng)包含了突變的位點)再次重組進基因組, 與此同時引入第二種抗生素基因, 以第二種抗生素篩選轉(zhuǎn)化子, 經(jīng)連續(xù)篩選, 即可獲得定點突變的轉(zhuǎn)化子[5—7]。由于這種方法涉及基因的刪除, 所以如果要對必需基因進行定點突變, 顯然不能采用這種方法。

本研究在參閱相關(guān)研究文獻[6—8]的基礎(chǔ)上, 采用了一種改進的方法, 對集胞藻的必需基因pet BD基因進行了定點突變。Pet BD基因編碼光合膜蛋白細胞色素 b6f蛋白復(fù)合體的細胞色素 b6和亞基Ⅳ這兩個蛋白亞基, 兩個基因之間有一段約200 bp的非編碼區(qū)。該方法基本原理是在構(gòu)建集胞藻同源重組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒時, 在定點突變位點上游的非編碼區(qū)內(nèi)引入一個特異酶切位點, 經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子后, 以引入的酶切位點作為第二個篩選標記鑒定轉(zhuǎn)化子。在本實驗中為獲得 pet D基因的定點突變株,在其上游pet B和pet D之間的非編碼區(qū)引入了一個HindⅢ酶切位點。本研究使用上述方法, 最終鑒定了三個 b6f蛋白復(fù)合體亞基Ⅳ的定點突變株, 單突Gly136Ala、單突Thr137Ala 以及雙突Gly136Ala/ Thr137Ala。該方法是在集胞藻常規(guī)同源重組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒構(gòu)建的基礎(chǔ)上稍加改進,克服了常規(guī)的基因敲除法不能構(gòu)建必需基因定點突變株的缺陷, 并且可以快速預(yù)篩選出定點突變株, 為后續(xù)的測序節(jié)約成本。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與培養(yǎng)條件

集胞藻6803藻種為本實驗室保存。集胞藻培養(yǎng)條件參照文獻[1, 9], 突變株培養(yǎng)時在培養(yǎng)基中加入終濃度為25 μg/mL的卡那霉素。

宿主菌E. coli DH5ɑ用于質(zhì)粒擴增的, 本實驗室保存的質(zhì)粒pET 30a, 宿主菌Trans-T1感受態(tài)細胞, pUC18質(zhì)粒購自TransGen公司。

1.2 試劑與工具酶

ExTaq DNA Polymerase、dNTP Mixture、Pfu DNAPolymerase 購自TaKaRa公司; 限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EheⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ購自Fermentas公司; DNA ligase、Trans Taq-T DNA Polymerase、Fast Mutagenesis System購自TransGen公司; 卡那霉素購自Sigma公司。DNA小提中量試劑盒, 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自索萊寶生化科技(北京)有限公司。PCR引物合成以及DNA序列測序交由北京三博遠志生物技術(shù)公司完成。

1.3 同源重組載體的構(gòu)建

參照Putnam-Evans等[6,7]和Yan等[8]的方法構(gòu)建載體,方法如下: 根據(jù)NCBI上提供的集胞藻6803petBD基因序列及其上下游序列和 pET 30a質(zhì)粒中抗卡那霉素基因的表達框序列, 分別設(shè)計引物(Up-F、Up-R、Down-F、Down-R和 Kanr-F、Kanr-R; 表 1), 以集胞藻基因組和pET30a質(zhì)粒為模板, 擴增出上、下游片段和抗性基因Kanr片段。按上游序列-Kanr片段-下游序列的順序連接到pUC18質(zhì)粒上。

采用 TransGen 公司的快速突變試劑盒(Fast Mutagenesis System), 選擇在petB和petD基因之間的非編碼區(qū)的一段序列AAGATT, 設(shè)計引物HindⅢ-F和HindⅢ-R(表 1), 進行一個堿基的突變, 引入 HindⅢ酶切位點(AAGCTT), 構(gòu)建成pUC-petBD同源重組質(zhì)粒。

根據(jù)集胞藻6803亞基IV的氨基酸編碼序列設(shè)計三個氨基酸定點突變質(zhì)粒的引物(G-F、G-R; T-F、T-R; D-F、D-R;表1), 采用TransGen公司的快速突變試劑盒, 以pUC-petBD質(zhì)粒為模板, 構(gòu)建三個氨基酸定點突變質(zhì)粒, 即單突Gly136Ala、單突Thr137Ala 和雙突Gly136Ala/Thr137Ala。

1.4 集胞藻6803的自然轉(zhuǎn)化

集胞藻6803的自然轉(zhuǎn)化按照Williams描述的方法[10]。

1.5 突變株的鑒定

以野生型集胞藻6803和三個定點突變株的基因組為模板, 分別用 K-F、K-R(表 2)引物鑒定 Kanr片段重組結(jié)果, HindIIIJD-F、HindIIIJD-R(表 2)引物鑒定引入的HindIII酶切位點是否已重組到集胞藻基因組中, 最后用petD-F、petD-R(表2)引物擴增petD片段, 進行測序驗證。

2 結(jié)果

2.1 定點突變轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建

同源重組質(zhì)粒 pUC-petBD的構(gòu)建圖譜見圖 1。為了驗證構(gòu)建的pUC-petBD載體上petB和petD之間是否引入HindIII酶切位點, 設(shè)計了引物HindIII JD-F和HindIII JD-R(表2), 用該引物對pUC-petBD載體進行擴增, 理論產(chǎn)物大小為616 bp, 酶切位點位于第216個堿基處。圖2是對引入的酶切位點鑒定的電泳圖, PCR產(chǎn)物大小為600 bp左右, HindⅢ酶切后產(chǎn)生大約200 bp和400 bp的2個片段, 與實驗設(shè)計吻合, 說明成功地在petB和petD之間引入了一個新的HindⅢ酶切位點。

表1 構(gòu)建同源重組載體定點突變載體所需的引物Tab. 1 Primer sequences for the construction of the site-directed mutagenesis plasmid based on homologous recombination

按照Transgen公司的Fast Mutagenesis System的操作, 以pUC-petBD質(zhì)粒為模板, 根據(jù)集胞藻Cyt b6f亞基IV的編碼序列分別設(shè)計引物(G-F、G-R; T-F、T-R; 表1),將petD的Gly136(GGC)突變成Ala(GCC)即單突Gly136Ala,Thr137(ACT)突變成Ala(GCT)即單突Thr137Ala。以及以單突Thr137Ala質(zhì)粒為模板, D-F和D-R(表1)為引物構(gòu)建雙突Gly136Ala/Thr137Ala。這三個定點突變的質(zhì)粒構(gòu)建完成, 經(jīng)測序驗證正確(數(shù)據(jù)未顯示)。

表2 PCR驗證突變株所用的引物序列Tab. 2 Primer sequences for the identification by PCR

圖1 同源重組載體pUC-petBD的構(gòu)建圖譜Fig. 1 Schematic describing the construction of the homologous recombinant vector pUC-pet BD

圖2 HindⅢ酶切 pUC-petBD載體PCR產(chǎn)物的電泳分析Fig. 2 An electrophoretogram of HindⅢ-restricted from pUC-petBD vector

2.2 集胞藻6803的轉(zhuǎn)化和Kanr突變株的篩選

將測序正確的三個定點突變質(zhì)粒分別與野生型集胞藻6803細胞混合, 進行轉(zhuǎn)化, 光照下孵育6h后, 涂布于不加卡那覆蓋有硝酸纖維素薄膜的BG-11固體培養(yǎng)基上, 生長2—3d后, 將濾膜轉(zhuǎn)到含有25 μg/mL 的卡那霉素固體板上培養(yǎng)。同時以野生型6803作對照。大約1周后, 野生對照沒有長出轉(zhuǎn)化子(圖3a), 而三個重組平皿分別長出單菌落(圖3 b, c, d)。

隨機挑取轉(zhuǎn)化子, 在25 μg/mL的卡那霉素BG11固體平板上進行抗性篩選, 通過 3—5次繼代篩選后, 以野生型集胞藻 6803和三個定點突變株的基因組為模板, 用K-F和K-R為引物(表2)進行PCR擴增。結(jié)果表明在野生型集胞藻6803中的PCR產(chǎn)物約為0.3 kb,而在篩選的12個突變株的PCR產(chǎn)物都為約1.7 kb, 多出了約1.4 kb的抗性基因Kanr(圖4)。這一結(jié)果表明, 在DNA水平上, 抗性基因已經(jīng)重組到了集胞藻中。

2.3 定點突變株株的驗證

以野生型集胞藻 6803和 12個成功重組抗性基因Kanr的突變株基因組為模板, HindⅢJD-F和HindⅢJD-R (表2)為引物進行PCR擴增。結(jié)果表明, 野生和12個突變株都能擴增出616 bp大小的DNA片段, 經(jīng)HindⅢ酶切后, 野生型6803的PCR產(chǎn)物片段不能被切開, 12個突變株中有5株P(guān)CR產(chǎn)物能夠切出約200 bp和約400 bp兩條帶, 其他 7株未被切開(圖 5)。這一結(jié)果表明, 上述 5株(其 PCR產(chǎn)物能被 HindⅢ酶切開的突變株), 上游同源序列的重組至少開始于petB和petD之間的HindⅢ酶切位點, 在一般情況下, 其后的氨基酸突變位點也應(yīng)該重組到集胞藻的基因組中。

圖3 在含25 μg/mL卡那霉素的BG-11固體板上生長的轉(zhuǎn)化子Fig. 3 Inducement of the transformants on BG-11 plate containing 25 μg/mL kanamycin (a) Wild type 6803; (b) Single mutant Gly136Ala; (c) Single mutant Thr137Ala; (d) Double mutant Gly136Ala/Thr137Ala

圖4 鑒定突變株是否插入Kanr片段Fig. 4 Identification of the Kanrfragment insertion at DNA level

圖5 鑒定突變株是否插入HindⅢ酶切位點Fig. 5 Identification of the Hind Ⅲ restriction site insertion at DNA level

以上述5株突變株(3、4、7、11、12)和另外7株(1、2、5、6、8、9、10)為模板, 用測序引物petD-F和petD-R(表2), 擴增 petD基因, 對 PCR產(chǎn)物進行測序驗證, 結(jié)果表明上述5個突變株確實發(fā)生了定點突變(測序結(jié)果未顯示),其中3、4為單突G136A, 7為單突T137A, 11、12為雙突G136A/T137A。而在其他7株當中, 經(jīng)測序驗證只有1株發(fā)生了定點突變, 另外 6株并未發(fā)生定點突變(測序結(jié)果未顯示)。

3 討論

集胞藻是光合作用等研究領(lǐng)域常用的一種模式生物, 它具有天然的同源重組特性[1—3]。采用分子生物學方法對目的蛋白進行功能研究時, 對于非必需基因, 無論是進行基因敲除還是定點突變, 已經(jīng)有了大量的研究,方法已經(jīng)非常成熟[4—7]。但是對于編碼細胞色素 b6f 的亞基Ⅳ蛋白的petD必需基因進行定點突變, 相關(guān)的研究報道不多。

在同源重組載體上游區(qū)域或下游區(qū)域設(shè)計突變位點,直接轉(zhuǎn)化集胞藻, 因為重組的起始和終止位點難于確定,無法保證突變位點能夠與基因組發(fā)生重組, 如果盲目地對每個轉(zhuǎn)化子進行測序, 無疑會加大工作量和成本。但是如果在突變位點上游或下游(如果是突變位點位于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒下游區(qū)域的情況)的非編碼區(qū)提前設(shè)計一個新的酶切位點, 本實驗中在Cyt b6亞基(petB編碼)和亞基Ⅳ(petD編碼)之間的非編碼區(qū)對一個堿基進行突變, 形成一個新的HindⅢ的特異酶切位點。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化子后, 擴增該酶切位點上下游區(qū)域, PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切可以鑒定該酶切位點是否重組進轉(zhuǎn)化子, 因為該 HindⅢ酶切位點在petD基因的上游, 顯然如果這一位點重組進了集胞藻基因組, 那么其下游的突變位點也應(yīng)該重組到野生 6803基因組中。因此在突變位點之前非編碼區(qū)引入特異酶切位點,可以看作是第二個篩選標記。

在本實驗中, 重組在引入的酶切位點之前發(fā)生的概率是比較高的, 實驗挑選了12個轉(zhuǎn)化子, 其中 6個發(fā)生了定點突變, 其中有 5個鑒定為重組發(fā)生在引入的酶切位點之前, 這可能是與引入的酶切位點與突變位點距離較近和該酶切位點上游的同源序列較長有關(guān)。上游同源序列總長約1.7 kb, 引入的HindⅢ酶切位點約在1.0 kb的位置, 定點突變的位點約在1.4 kb的位置, 則酶切位點之前的同源區(qū)為約1.0 kb, 其與定點突變的位點相差約0.4 kb。即使這樣, 在實驗中仍發(fā)現(xiàn)了雖然抗性基因 Kanr已經(jīng)重組到基因組中, 但是 HindⅢ酶切反應(yīng)成陰性, 并且測序也發(fā)現(xiàn)未發(fā)生定點突變的情況(挑選的12個轉(zhuǎn)化子中有6個屬于這種情況)。不難想象, 如果遇到突變位點(或者是引入的酶切位點)之前的同源序列較短的情況, 這種方法的優(yōu)勢可能會更加顯著。因為在這種情況下, 同源重組發(fā)生在突變位點下游的概率就會增加, 即突變位點的序列不發(fā)生同源重組, 那么利用突變位點之前引入的酶切位點為篩選標記, 然后對酶切反應(yīng)呈陽性的轉(zhuǎn)化子進行測序, 這樣就避免了后續(xù)實驗的盲目性, 大大提高篩選的效率。

綜上所述, 應(yīng)用本方法對petD這樣的必需基因進行定點突變, 只需構(gòu)建一次質(zhì)粒, 進行一次轉(zhuǎn)化, 剩下的工作主要是應(yīng)用常規(guī)的PCR和酶切對抗生素平板上的轉(zhuǎn)化子進行驗證, 實驗方法簡單。該方法不但克服了常規(guī)方法不能用來構(gòu)建必需基因定點突變的缺點, 并且可以簡單快速預(yù)篩選出定點突變株, 對其他必需基因定點突變的研究具有借鑒意義。

[1] Yan C L, Xu X D. Isolation and characterization of mutants impaired in photoautotrophic growth in Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(2): 360—362 [閻春蘭, 徐旭東. 集胞藻 6803光合自養(yǎng)生長突變株的篩選與鑒定. 水生生物學報, 2009, 33(2): 360—362]

[2] Fu J, Xu X D. A priA mutant of Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 32(1): 116—119 [付娟, 徐旭東. 集胞藻PCC6803priA 基因的突變體. 水生生物學報, 2008, 32(1): 116—119]

[3] Long Z J, Wang Q X, Ma W M, et al. Construction of the ndhO gene inactivation mutant of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 [J]. China Biotechnology, 2010, 30(9): 31—35 [龍宗娟, 王全喜, 馬為民, 等. 利用同源重組構(gòu)建藍藻集胞藻 6803ndhO基因突變株及其分子鑒定.中國生物工程雜志, 2010, 30(9): 31—35]

[4] Gao H, Tang Q, Xu X D. Construction of copper-induced gene expression platform in Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2007, 31(2): 240—244 [高宏,唐蜻, 徐旭東. 集胞藻 PCC6803銅離子誘導(dǎo)表達平臺的構(gòu)建. 水生生物學報, 2007, 31(2): 240—244]

[5] Wang M, Shan J X, Kuang T Y, et al. Advances in the research of structure and function of photosystemⅡ core antenna complexes CP43 and CP47 [J]. Chinese Bulletin of Botany, 2000, 17(2): 141—149 [王梅, 單際修, 匡廷云, 等.光系統(tǒng)Ⅱ核心天線復(fù)合物CP43和CP47結(jié)構(gòu)與功能研究進展. 植物學通報, 2000, 17(2): 141—149]

[6] Cindy Putnam-Evans, Jituo Wu, Terry M Bricker. Site-directed mutagenesis of the CP 47 protein of photosystem Ⅱ: alteration of conserved charged residues which lie within lethal deletions of the large extrinsic loop E [J]. Plant Molecular Biology, 1996, 32(6): 1191—1195

[7] Cindy Putnam-Evans, Terry M Bricker. Site-directed mutagenesis of the CPa-1 protein of photosystem II: alteration of the basic residue pair384,385R to384,385G leads to a defect associated with the oxygen-evolving complex [J]. Biochemistry, 1992, 31: 11482—11488

[8] Yan J, Dashdorj N, Cramer W A, et al. On the structural role of the aromatic residue environment of the chlorophyll a in the cytochrome b6f complex [J]. Biochemistry, 2008, 47(12): 3654—3661

[9] Allen M M. Simple conditions for growth of unicellular blue-green algae on plates [J]. Journal of Phycology, 1968, 4(1): 1—4

[10] Williams J G K. Construction of specific mutations in photosystem Ⅱ photosynthetic reaction center by genetic engineering method in Synechocystis 6803 [J]. Methods in Enzymology, 1988, 167: 766—778

A RAPID METHOD FOR SITE-DIRECTED MUTAGENESIS OF THE ESSENTIAL GENE PETBD IN SYNECHOCYSTIS SP. PCC 6803

LU Ya-Fei1, QU Na1, CHEN Xiao-Bo1and KUANG Ting-Yun2
(1. College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Key Laboratory of Photobiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)

定點突變; pet BD必需基因; 酶切位點; 集胞藻6803

Site-directed mutagenesis; Pet BD essential gene; Restriction site; Synechocystis sp. PCC 6803

Q784; Q-33

A

1000-3207(2014)05-0957-05

10.7541/2014.141

2013-07-01;

2014-02-12

國家“973”項目(2011CBA00901)資助

蘆亞菲(1988—), 女, 河北石家莊人; 碩士生; 細胞色素b6f復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail: 630540631@qq.com

陳曉波(1975—), 男, 河北邯鄲人; 博士; 主要從事細胞色素b6f復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail: zzschenxiaobo@163.com