高溫短程反硝化菌Brevibacillus sp.XF-03特性及其降解動(dòng)力學(xué)

郝敏娜 楊云龍 葛啟隆
（太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024）

采用梯度馴化方法，使得菌株Brevibacillus sp.XF-03在高溫（50℃）條件下，能夠降解1 000 mg/L亞硝態(tài)氮，并通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)其生長(zhǎng)碳源和C/N進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化最適碳源為琥珀酸鈉，C/N為12∶1。在此最佳條件下，42 h對(duì)初始濃度為100 mg/L亞硝態(tài)氮去除率為95.1%。對(duì)該菌株亞硝態(tài)氮降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行模擬，符合基質(zhì)抑制型的 Haldane 模型，各參數(shù)分別為：最大比降解速率（μmax）=1.28 h-1，半飽和常數(shù)（KS）=451.42 mg/L，底物抑制常數(shù)（Ki）=176.77 mg/L。初步探討了亞硝酸鹽還原酶（NIR）活性，在該菌株生長(zhǎng)指數(shù)期的后期，亞硝酸鹽還原酶比活力達(dá)0.279（U/ mg protein）。

Brevibacillus sp.XF-03 高溫 短程反硝化 亞硝態(tài)氮降解動(dòng)力學(xué) 酶活性

隨著工業(yè)化的發(fā)展，水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，去除水中氮素污染已成為當(dāng)今水污染防治領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題［1，2］。目前普遍認(rèn)為生物脫氮是從污水中去除氮素污染的經(jīng)濟(jì)有效的方法之一［3，4］。在諸多污水脫氮新技術(shù)中，應(yīng)用廣泛、發(fā)展較快及最經(jīng)濟(jì)高效的有短程硝化反硝化、同步硝化反硝化及厭氧氨氧化等，它們因具有節(jié)省曝氣量、提高反應(yīng)速率、節(jié)約碳源、縮短反應(yīng)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)［5］，越來(lái)越受到人們的重視［6，7］，實(shí)現(xiàn)這些新技術(shù)的關(guān)鍵是獲得具有較高脫氮能力的微生物。此外，以上新技術(shù)多適用處理中低溫環(huán)境的污水［8，9］，若處理高溫污水則需對(duì)污水進(jìn)行降溫，這給生物法處理高溫污水帶來(lái)較大困難。

本文研究菌株Brevibacillussp.XF-03的高溫短程反硝化特性及其亞硝態(tài)氮降解動(dòng)力學(xué)，以期為短程硝化反硝化工藝的應(yīng)用以及傳統(tǒng)反硝化過(guò)程中亞硝

態(tài)氮積累問(wèn)題的解決提供技術(shù)參數(shù)與新的菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株：Brevibacillussp.XF-03，來(lái)源于太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)鑒定為短芽孢桿菌屬（Brevibacillussp.），GenBank登錄號(hào)為 KF052620。試驗(yàn)初步證明在高溫條件（50℃）下，該菌具有較好的短程反硝化能力。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB富集培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10；酵母浸出粉 5；NaCl 10；pH7.0-7.5。

短程反硝化培養(yǎng)基（g/L）：NaNO2適量；KH2PO41.5；Na2PO4·7H2O 7.9；MgSO4·7H2O 0.1；琥珀酸鈉適量；微量元素溶液2 mL；pH 7.0-7.5。

微量元素溶液成分（g/L）：EDTA 50.0；ZnSO42.2；CaCl25.5；MnCl2·4H2O 5.06；FeSO4·7H2O 5.0；（NH4）6Mo7O2·4H2O 1.1；CuSO4·5H2O 1.57；CoCl2·6H2O 1.61；pH7.0-7.5。

以上培養(yǎng)基121℃高壓滅菌20 min，固體平板和斜面培養(yǎng)基均在上述培養(yǎng)基中加入1.8%的瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 菌株Brevibacillus sp.XF-03的短程反硝化馴化 將本實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株Brevibacillussp.XF-03接種至裝有LB培養(yǎng)液的三角瓶中，30℃，160 r/min搖床振蕩活化2代，并將次級(jí)培養(yǎng)物活化至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，作為接種體使用。取活化后的菌液10 mL，接入裝有100 mL培養(yǎng)液的三角瓶中，搖床恒溫振蕩。以琥珀酸鈉作為唯一碳源和能源，利用NO2

--N作為唯一氮源，采用梯度馴化的方法首先對(duì)細(xì)菌進(jìn)行升溫培養(yǎng)。馴化培養(yǎng)過(guò)程按10%梯度接種的方法，溫度梯為：30℃→35℃→40℃→43℃→46℃→48℃ →50℃。菌株在50℃下生長(zhǎng)穩(wěn)定后，再對(duì)其進(jìn)行亞硝態(tài)氮濃度梯度馴化。亞硝態(tài)氮濃度梯度增加依次為：50、100、150、 200 、300、400、500、600、700、800、1 000 mg/L。同時(shí)，在馴化的過(guò)程中定期監(jiān)測(cè)水質(zhì)并觀察微生物的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 菌株Brevibacillussp.XF-03短程反硝化條件優(yōu)化 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液接入100 mL短程反硝化培養(yǎng)基中，通過(guò)調(diào)節(jié)碳源（葡萄糖、苯酚、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、乙醇、琥珀酸鈉）和 C/N（3∶1，6∶1，9∶1，12∶1，15∶1，20∶1），50℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，定期測(cè)定培養(yǎng)液中菌體生長(zhǎng)量與NO2

--N含量?？疾焯荚磁c碳氧化（C/N）對(duì)菌株Brevibacillussp.XF-03生長(zhǎng)及短程反硝化能力的影響，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 短程反硝化動(dòng)力學(xué)研究 在最佳試驗(yàn)條件下，應(yīng)用Haldane方程對(duì)菌株生長(zhǎng)和亞硝態(tài)氮降解特性進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究［10］。為用回歸曲線求出準(zhǔn)確的動(dòng)力學(xué)方程，動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)在較寬的NO2--N含量范圍內(nèi)進(jìn)行，即0-1000 mg/L。NO2--N濃度選擇如下：0-200 mg/L之間，每40 mg/L一個(gè)濃度梯度；200-600 mg/L之間，每100 mg/L一個(gè)濃度梯度；600-1000 mg/L之間，每200 mg/L一個(gè)濃度梯度。將菌懸液分別接種到裝有上述不同初始NO2--N濃度的短程反硝化培養(yǎng)基中，搖瓶振蕩培養(yǎng)，每隔適宜時(shí)間取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中的菌體含量和殘余NO2--N含量。

1.2.4 粗酶液的提取 將處于不同生理時(shí)期的菌液離心（8 000 r/min，10 min），棄去上清液，收集菌體，用0.01 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH7.2）清洗后重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)3次，留取菌體沉淀。按原菌液體體積的1/5-1/10加入裂解液，制成懸浮菌液，裂解液的成分為：pH8.0的50 mmol/L Tris-HCI緩沖液、2 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，置于冰水浴中超聲破碎。破碎液于12 000 r/min，4℃離心20 min，收集上清液即為粗酶［11］，低溫保存待用。

1.2.5 菌體OD600測(cè)定 可見(jiàn)分光光度法，細(xì)胞干重采用干燥恒重法測(cè)量，根據(jù)細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度轉(zhuǎn)換為細(xì)胞干重［12］；亞硝態(tài)氮測(cè)定：N-（1-萘基）-乙二胺光度法［13］；亞硝酸鹽還原酶（NIR）活力測(cè)定：測(cè)定系統(tǒng)總體系3 mL，內(nèi)含1.0 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH7.2），1 mL粗酶液以及1 mL 0.01 mol/L的亞硝酸鈉溶液，試劑全部加入后立即取適量上述混合液，測(cè)340 nm處的吸光度，剩余待測(cè)液在常溫靜置20 min后測(cè)其340 nm處的吸光度［14］。定義亞硝酸鹽還原酶（NIR）活力單位（U）為每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol亞硝酸鹽氮所需酶量。總蛋白含量用Bradford法測(cè)定［15］，酶的比活力以每毫克蛋白質(zhì)中所含酶的活力單位數(shù)計(jì)算。試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析借助Matlab軟件。

2 結(jié)果

2.1 碳源對(duì)菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化影響

圖1為不同碳源情況下，42 h后菌株各自生長(zhǎng)及NO-

2-N降解情況。由圖1可以看出菌株Brevibacillussp.XF-03短程反硝化的順利進(jìn)行對(duì)碳源有一定的選擇性。該菌幾乎不能以乙醇、苯酚、酒石酸鉀鈉作為唯一碳源生長(zhǎng)；而對(duì)葡萄糖而言，菌體在其中所需的適應(yīng)階段較長(zhǎng)，亞硝態(tài)氮降解也不充分，可能是由糖類(lèi)物質(zhì)降解過(guò)程的復(fù)雜性引起的。分別以檸檬酸鈉和琥珀酸鈉為碳源時(shí)，菌株Brevibacillussp.XF-03均能較好地生長(zhǎng)，與以檸檬酸鈉為碳源相比，當(dāng)以琥珀酸鈉為碳源時(shí)，亞硝態(tài)氮降解率較高42 h亞硝態(tài)氮由100 mg/L降解到5.9 mg/L，降解率達(dá)94.1%，說(shuō)明琥珀酸鈉為該菌株的最適碳源。

圖1 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及NO-2-N降解的影響

2.2 碳氮化對(duì)菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化影響

以琥珀酸鈉為唯一碳源，亞硝酸鈉為唯一氮源，固定碳源含量，通過(guò)調(diào)節(jié)亞硝酸鈉含量控制碳氮比。由圖2可知，當(dāng)碳氮化（C/N）小于12時(shí)，亞硝態(tài)氮去除率及菌株生長(zhǎng)情況隨著C/N增加而提高，C/N大于12時(shí)，亞硝態(tài)氮去除率及菌株生長(zhǎng)情況趨于平緩，提高不明顯。綜合考慮，確定菌株Brevibacillussp.XF-03的最適碳氮比為12∶1。

2.3 菌株Brevibacillus sp.XF-03短程反硝化特性

圖2 碳氮比（C/N）對(duì)菌體生長(zhǎng)及NO2--N降解的影響

在最適碳源及碳氮比，培養(yǎng)液初始NO-2-N濃度為100 mg/L條件下，菌株Brevibacillussp.XF-03生長(zhǎng)及亞硝酸鹽降解曲線如圖3。經(jīng)18 h的適應(yīng)期后菌株Brevibacillussp.XF-03進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在該時(shí)期內(nèi)，短程反硝化作用明顯加強(qiáng)，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期（18-36 h）是細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖最旺盛的時(shí)期，細(xì)胞合成所需要的能量和還原力主要在這一階段被消耗，因此反硝化作用主要在這一時(shí)段內(nèi)完成。培養(yǎng)42 h，NO-

2-N從100 mg/L降 至4.90 mg/L， 去 除 率 為95.1%。在對(duì)數(shù)期后期，有效細(xì)菌的數(shù)目雖逐漸減少，而亞硝酸鹽仍有少量降低，此時(shí)很可能是細(xì)菌的同化起主要作用。

圖3 菌株Brevibacillus sp.XF-03生長(zhǎng)曲線及亞硝態(tài)氮變化

2.4 亞硝態(tài)氮降解動(dòng)力學(xué)

短程反硝化菌在以亞硝酸鹽氮為底物進(jìn)行反硝化的過(guò)程中，亞硝態(tài)氮對(duì)微生物有一定的毒害作用，當(dāng)其濃度達(dá)到一定值時(shí)，也會(huì)對(duì)反硝化過(guò)程產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致反應(yīng)速率下降，因此建立動(dòng)力學(xué)模型時(shí)，需要選擇一種非競(jìng)爭(zhēng)性底物抑制模型，已經(jīng)有多種底物抑制模型被建立，其中Haldane模型是最常見(jiàn)的模型，定義如下式：

μ=μmaxC/（Ks+C+C2/Ki） （1）

式中，μ為底物比降解速率（h-1）；μmax為最大比降解速率（h-1）；C為底物初始濃度（mg/L）；KS

為半飽和常數(shù)（mg/L）；Ki為底物抑制常數(shù)（mg/L）。

試驗(yàn)假定亞硝態(tài)氮是菌株Brevibacillussp.XF-03比生長(zhǎng)速率的單一限制性底物，搖瓶中的溶氧為常數(shù)且為非限制性因素。對(duì)于每一個(gè)初始亞硝態(tài)氮濃度（C），比生長(zhǎng)速率（μ） 由指數(shù)生長(zhǎng)期決定。對(duì)每一個(gè)搖瓶指數(shù)生長(zhǎng)期的菌體濃度和時(shí)間的半對(duì)數(shù)圖做線性最小二乘擬合得，在指數(shù)生長(zhǎng)期，μ 約為一個(gè)常數(shù)。

運(yùn)用Matlab軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到亞硝酸鹽抑制動(dòng)力學(xué)方程式（2）。模型相關(guān)性系數(shù)R2為0. 992，說(shuō)明擬合曲線與試驗(yàn)實(shí)測(cè)值相關(guān)性良好。

μ=1.28C/（451.42+ C+C2/176.77） （2）

模擬曲線如圖4所示。底物比降解速率（μ）隨著亞硝態(tài)氮初始濃度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，這是典型的抑制生長(zhǎng)模式，最大比降解速率發(fā)生在亞硝態(tài)氮濃度為282.48 mg/L處，隨著初始亞硝態(tài)氮濃度的繼續(xù)增加，其比降解速率逐漸減小，在這一過(guò)程中，亞硝態(tài)氮抑制作用占主導(dǎo)。此外，反應(yīng)體系中代謝物的積累也是造成亞硝態(tài)氮比降解速率下降的原因之一。

圖4 亞硝酸鹽氮降解動(dòng)力學(xué)擬合曲線

2.5 酶活性的測(cè)定

以琥珀酸鈉為碳源，C/N=12，初始亞硝態(tài)氮濃度為282.48 mg/L，研究菌株Brevibacillussp.XF-03亞硝酸鹽還原酶活性。由圖5可知，菌株Brevibacillussp.XF-03在生長(zhǎng)停滯期，亞硝酸鹽還原酶活性較低，亞硝態(tài)氮降解率僅有12.56%，在其生長(zhǎng)指數(shù)期的后期，產(chǎn)生大量亞硝酸鹽還原酶，且亞硝酸鹽還原酶的比活力達(dá)到最大值0.279（U/mg protein），亞硝態(tài)氮降解速率提高，說(shuō)明脫氮過(guò)程中菌株不同生長(zhǎng)階段亞硝態(tài)氮還原酶的活力不同，亞硝酸鹽還原酶是短程反硝化菌降解亞硝態(tài)氮的關(guān)鍵酶。

圖5 菌體生長(zhǎng)，亞硝態(tài)氮降解及亞硝態(tài)氮還原酶比活力變化曲線

3 討論

反硝化微生物大多數(shù)需要碳源作為電子供體，具有較廣泛的碳源譜，碳源的種類(lèi)影響到反硝化強(qiáng)度［16］。Martienssen等［17］認(rèn)為有機(jī)碳源的數(shù)量和種類(lèi)是影響反硝化微生物菌落結(jié)構(gòu)的重要因素之一，這與本研究結(jié)論一致。同時(shí)，研究表明碳氮比也是影響微生物脫氮效果的重要因素之一，低碳氮比條件下，NO-2和N2O均可利用內(nèi)碳源進(jìn)行反硝化，氧化亞氮還原酶競(jìng)爭(zhēng)電子的能力較弱，反硝化過(guò)程出現(xiàn)N2O積累。碳源充足，亞硝態(tài)氮還原酶和氧化亞氮還原酶同時(shí)利用外碳源進(jìn)行反硝化，初始階段產(chǎn)生的N2O在接下來(lái)的反硝化過(guò)程中被迅速還原為N2［18］。碳源不足，反硝化速率降低；碳源過(guò)量雖可提高系統(tǒng)反硝化脫氮能力，但增加了碳源消耗，同時(shí)也增加了耗氧量。

目前，已發(fā)現(xiàn)多種反硝化菌，主要分布于Pseudomonas、Alcaligenes和Bacillus三個(gè)屬［19］。對(duì)反硝化微生物的研究主要集中于以硝酸鹽氮為電子受體的反硝化菌，對(duì)亞硝酸型反硝化菌的研究集中在混合菌反應(yīng)器運(yùn)行上［20，21］，而對(duì)在溫度與亞硝態(tài)氮含量均較高的條件下短程反硝化單菌種的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。亞硝酸型反硝化是一個(gè)復(fù)雜生化過(guò)程，是短程硝化反硝化的重要過(guò)程。本研究采用梯度馴化得到高效的短程反硝化菌，優(yōu)化影響短程反硝化的環(huán)境因子，構(gòu)建亞硝酸鹽氮降解動(dòng)力學(xué)模型及初步探討其酶活，以期為短程硝化反硝化工藝的應(yīng)用以及傳統(tǒng)反硝化過(guò)程中亞氮積累問(wèn)題的解決提供技術(shù)參數(shù)。同時(shí)短程反硝化微生物的特性、亞硝酸鹽還原酶的

表達(dá)及其應(yīng)用有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

馴化得到高溫短程反硝化菌Brevibacillussp.XF-03，該菌株最佳生長(zhǎng)碳源為琥珀酸鈉，碳氮比（C/N）為12。

動(dòng)力學(xué)模型具有良好的有效性，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.992。

亞硝酸鹽還原酶是短程反硝化菌降解亞硝態(tài)氮的關(guān)鍵酶，在菌株Brevibacillussp.XF-03生長(zhǎng)指數(shù)期的后期，產(chǎn)生大量亞硝酸鹽還原酶，且亞硝酸鹽還原酶的比活力達(dá)到最大值0.279（U/mg protein）。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Characteristics and Degradation Kinetics of Thermophilic Shotcut Denitrifier Brevibacillus sp.XF-03

Hao Minna Yang Yunlong Ge Qilong
（College of Environmental Science and Engineering，Taiyuan University of Technology，Taiyuan 030024）

The denitrifier Brevibacillus sp. XF-03 could reduce high nitrite concentration（1 000 mg/L）under the condition of high temperature（50℃）by the method of gradient domestication. The effects of carbon source and C/N on growth and denitrification of the denitrifier were optimized by single factor experiments. The results showed that the optimum shortcut denitrification carbon source of Brevibacillus sp. XF-03 was sodium succinate, optimum C/N ratio 12∶1. Under the optimal condition, the nitrite removal efficiency reached 95.1% within 42 hours when the original concentration of NO-2-N was 100 mg/L. Nitrite degradation kinetic studies indicated that the strain followed Haldane’s model, and the parameters were：μmax（maximum specific rate）=1.28 h-1, Ks（half-satruration constant）=451.42 mg/L, Ki（inhibition constant）= 176.77 mg/L. Nitrite reductase（NIR）activity was preliminary discussed. The NIR specific activity reached 0.279（U/mg protein）at the lag phase of exponential growth.

Brevibacillus sp.XF-03 High temperature Shortcut denitrification Nitrite degradation kinetics Enzyme activity

2013-07-29

郝敏娜，女，碩士研究生，研究方向：水污染控制；E-mail：tyuthaominna@163.com