柴油高效降解菌株篩選及降解特性研究

岳貴龍 陳亮 劉娜
（河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州 450001）

采用梯度富集培養(yǎng)、稀釋涂布從受石油污染的樣品中，分離得到柴油降解菌株10株，其中菌株YR2柴油降解率最高，在含柴油1%（w/v）的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，降解率達到92.8%，在2%、4%、5%的柴油濃度下降解率分別為60.8%、53.5%、41.0%。綜合菌株形態(tài)特征觀察、生理生化特性分析和16S rDNA序列比對，菌株YR2應為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。菌株YR2具有較好的細胞表面疏水性、乳化性能和排油性能。薄層層析結果表明菌株YR2分泌糖脂類表面活性劑。菌株YR2具有高效的柴油降解能力，有望應用于柴油污染的微生物修復。

柴油 假單胞菌 糖脂 細胞表面疏水性 微生物降解

柴油污染對土壤和水體環(huán)境威脅巨大，具有致癌、致畸、致突變等危害，直接影響到生態(tài)系統(tǒng)平衡和人體健康。常規(guī)物理化學方法處理柴油污染物，能耗和處理成本高，易對環(huán)境造成二次污染。而采用微生物降解的方法處理柴油污染物具有明顯的優(yōu)勢［1］。

國內外已有研究證明柴油污染微生物修復技術的基礎和關鍵是篩選高效的柴油降解微生物。但是，目前柴油降解菌株大多是在柴油濃度1%或者更低濃度下分離篩選得到的［2-5］，而實際污染物中柴油濃度遠遠高于1%。低濃度柴油下篩選得到的降解菌株在實際應用中柴油降解效果欠佳。

本文從受石油污染的樣品中通過梯度富集培養(yǎng)分離篩選高濃度柴油降解菌株，并對降解菌株的乳化性能、排油性能和細胞表面疏水性進行研究，以期為柴油污染微生物修復提供菌株和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 中原油田、南陽油田、普光油氣田等

地受石油污染土壤以及油基鉆屑。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機鹽液體培養(yǎng)基：NH4NO32 g，K2HPO41.5 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，無水氯化鈣 0.01 g，Na2EDTA·2H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4。

油平板培養(yǎng)基：無機鹽液體培養(yǎng)基1 000 mL，柴油10 mL，瓊脂18 g。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基［6］（NA培養(yǎng)基）。

1.2 方法

1.2.1 梯度富集培養(yǎng) 取樣品10 g加入到100 mL含柴油1%（w/v）的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、170 r/min富集培養(yǎng)5 d后，以5%的接種量接入到柴油濃度2%的無機鹽液體培養(yǎng)基繼續(xù)富集培養(yǎng)5 d，然后依次轉入到柴油濃度3%、4%、5%的無機鹽液體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)。取培養(yǎng)液在固體油平板上進行稀釋涂布，挑取生長迅速的菌落進行劃線分離純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 柴油降解率測定 將菌株活化培養(yǎng)液以5%（v/v）的接種量接入不同柴油濃度的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、170 r/min下培養(yǎng)7 d后，采用重量法［7］測定柴油降解率，以不接菌的培養(yǎng)液作為空白對照，每個試驗重復3次。降解率計算公式如下：

降解率（%）=W0-W1/W0×100%

W0是對照組殘油質量（g），W1是試驗組殘油質量（g）。

1.2.3 柴油降解菌株鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［8］進行菌株形態(tài)特征觀察和生理生化特性分析。菌株形態(tài)特征觀察包括菌落形態(tài)觀察、結晶紫染色、革蘭氏染色，生理生化特性分析包括需氧性試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、運動性試驗、氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、吲哚試驗等。

菌株16S rDNA序列比對參照文獻［9］進行。使用細菌基因組提取試劑盒（北京鼎國）提取菌株基因組DNA，以細菌16S rDNA擴增通用引物27F和1492R進行PCR擴增，PCR產物經電泳檢測后送樣測序。

1.2.4 菌株降解特性

1.2.4.1 乳化性能 菌株于柴油無機鹽液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，于12 000 r/min離心20 min，收集發(fā)酵上清液，于帶刻度試管中加入等體積的發(fā)酵上清液和柴油，充分振蕩5 min后靜置24 h，觀察并記錄乳化層高度和穩(wěn)定性，計算乳化指數(shù)（EI）［10］。以未接種的培養(yǎng)液作為空白對照。

1.2.4.2 排油性能 發(fā)酵液排油性能以排油圈直徑計，采用排油圈法［10］測定。

1.2.4.3 表面活性物質分析 發(fā)酵液表面活性物質分析采用薄層層析法。將等體積的發(fā)酵上清液和萃取液（氯仿∶甲醇=2∶1）混合，充分振蕩后取樣進行薄層層析，展開后用苯酚硫酸試劑顯色。

1.2.4.4 菌體細胞表面疏水性 細胞表面疏水性以細胞表面疏水率計，測定采用Rosenberg測定方法的改進方法［11］。菌株于柴油無機鹽液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，離心后重懸于滅菌的無機鹽液體培養(yǎng)基中，取懸浮液1.5 mL調節(jié)OD600至0.5，加入200 μL柴油渦旋3 min，靜置待水相和油相分層后，記錄懸浮液OD600的變化。以無機鹽液體培養(yǎng)基為空白對照，每個試驗重復3次。細胞表面疏水率計算公式如下：

細胞表面疏水率（%）=（1-Ac/A0）×100%

Ac和A0分別是振蕩后懸浮液的吸光值和振蕩前懸浮液的吸光值。

2 結果

2.1 柴油降解菌株篩選

經富集培養(yǎng)后分離純化得到能以柴油作為唯一碳源的細菌10株，其中菌株YR2降解效果最好。分別在柴油濃度1%、2%、4%、5%的無機鹽液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，降解率分別為92.8%、60.8%、53.5%、41.0%。

2.2 菌株鑒定

圖1 菌株YR2形態(tài)特征

如圖1所示，菌株YR2在NA平板上菌落黃色微綠、不透明，菌落表面有褶皺、邊緣裂紋，產黃

綠色色素；細胞短桿狀，單個或成對出現(xiàn)，革蘭氏陰性，無芽孢；菌株YR2需氧生長，利用葡萄糖產酸不產氣，運動性、氧化酶試驗、硝酸鹽還原為陽性，甲基紅試驗、V-P試驗、吲哚試驗為陰性，菌株YR2生理生化特性與銅綠假單胞菌基本保持一致。

菌株YR2的16S rDNA序列（GeneBank登錄號KF530279）經BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與Pseudomonas aeruginosastrain S25（DQ095913） 和Pseudomonas aeruginosastrain D1（KF113578）的同源性均為99%，構建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 菌株YR2系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合菌株形態(tài)特征觀察、生理生化特性分析和16S rDNA序列比對，菌株YR2為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

2.3 菌株降解特性

2.3.1 乳化性能 如圖3所示，菌株發(fā)酵液對等體積柴油的乳化效果明顯，乳化指數(shù)高達75%，且靜置24 h后乳化層仍然穩(wěn)定，表明菌株YR2在生長代謝過程中分泌高效表面活性物質，有效增加了菌株菌體細胞與烴類物質的接觸面積。

圖3 菌株YR2發(fā)酵液乳化效果

2.3.2 發(fā)酵液排油性能 向油膜中心滴加培養(yǎng)5 d后的發(fā)酵液，經測定排油圈直徑為7.7 cm，表明菌株在發(fā)酵液中分泌有高效表面活性物質。

2.3.3 表面活性物質定性分析 薄層層析展開后經苯酚硫酸試劑顯色，出現(xiàn)糖脂類物質的棕色斑點，Rf值0.67，與鼠李糖脂標準品Rf值接近，由此可初步判斷菌株產糖脂類表面活性劑。

2.3.4 細胞表面疏水性 菌株YR2在柴油濃度為2%、4%、5%的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，細胞表面疏水率分別為54.1%、54.3%、66.4%，說明菌株具有良好的細胞表面疏水性。

圖4所示為菌株YR2細胞與油滴微粒的黏附現(xiàn)象。取菌株發(fā)酵液與美蘭染液混合后于光學顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)在油滴微粒周圍吸附有大量的菌體細胞（菌體細胞藍色、較小，油滴透明、較大），

即在菌株分泌的表面活性物質作用下，疏水性油滴被分散為微粒進入水相，進而形成了油滴-菌體細胞-水的混合體系。

3 討論

菌株YR2柴油降解能力明顯高于國內外相關報道，詳見表1。由表1可知，國內外目前關于柴油降解微生物菌株的研究大多在低濃度柴油（1%）下進行。高濃度柴油會對微生物細胞產生明顯毒害作用以及形成的油膜會阻隔菌體細胞與外界環(huán)境的物質運輸，導致微生物菌株不能良好地生長。本研究采用梯度富集培養(yǎng)篩選柴油降解菌株，提高了菌株對高濃度柴油的適應性。

表1 不同柴油濃度下菌株YR2降解能力

菌株YR2在柴油濃度2%、4%、5%條件下，細胞表面疏水率分別為54.1%、54.3%、66.4%。即隨著柴油濃度的升高，菌株YR2的細胞表面疏水率也隨之升高，也說明菌株細胞經過富集培養(yǎng)后對于高濃度柴油具有較好的適應性。

現(xiàn)有研究顯示，疏水性的烴類化合物由于其本身具有較高疏水性、固液分配系數(shù)，影響其與細菌細胞的黏附，只能通過非特定擴散機理并在疏水性最高的區(qū)域進入細胞內［16］。而良好的菌株細胞表面疏水性可以促進菌體細胞、疏水性油滴微粒的充分黏附，從而促進菌體細胞對烴類物質的攝取和降解。

菌體細胞表面疏水性高低將決定著烴類物質從胞外環(huán)境進入到胞內的難易［17］，因此，細胞表面疏水性越高，越有利于菌體細胞與烴類物質的黏附接觸，進而促進菌株對烴類物質的降解［18］。那么，柴油降解菌株的選育過程中菌株細胞表面疏水性和降解率同樣重要。

4 結論

經梯度富集培養(yǎng)分離篩選得到一株高效柴油降解菌株YR2，經鑒定菌株應為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

菌株YR2在1%、2%、4%、5%的柴油濃度下降解率分別為92.8%、60.8%、53.5%、41.0%。

菌株YR2對柴油乳化效果明顯且穩(wěn)定，菌株發(fā)酵液排油性能良好。菌株YR2具有較好的細胞表面疏水性，可分泌糖脂類表面活性物質。

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（責任編輯 李楠）

Screening of Diesel-degrading Strains and Their Degrading Characteristics

Yue Guilong Chen Liang Liu Na
（College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

Ten diesel-degrading strains were isolated from oil-contaminated samples by gradient enrichment culture and dilution coating. Strain YR2 with highest diesel degradation ability was chosen for further study. The degradation rate of strain YR2 was 92.8% when it was inoculated in mineral medium with diesel concentration of 1 g/100 mL for 7 days. The degradation rate was respectively 60.8%, 53.5% and 41.0% when the diesel concentration was 2 g/100 mL, 4 g/100 mL and 5 g/100 mL. Based on morphological, physiological-biochemical features and 16S rDNA sequences comparison, strain YR2 was identified as Pseudomonas aeruginosa. Strain YR2 has the excellent cell surface hydrophobicity, emulsifying ability and oil displacement ability. Strain YR2 can produce glycolipid biosurfactant. Strain YR2 with efficient diesel degradation ability has the potential application in the microbial remediation of diesel pollution.

Diesel Pseudomonas sp. Glycolipid Cell surface hydrophobicity Microbial degradation

2013-11-07

國家自然科學基金項目（U1304332），河南工業(yè)大學引進人才專項基金資助項目（2009BS052），河南工業(yè)大學?？茖W研究基金研究生教育創(chuàng)新計劃項目（2012YJCX49）

岳貴龍，男，碩士研究生，研究方向：應用微生物；E-mail：yueguilong@163.com

陳亮，副教授，博士，研究方向：應用微生物；E-mail：chenliang@haut.edu.cn