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        香菇dsRNA病毒LeV的RT-PCR檢測(cè)

        2014-03-17 11:46:51郭杰,吳小平
        生物技術(shù)通報(bào) 2014年1期
        關(guān)鍵詞:香菇核酸基因組

        香菇dsRNA病毒LeV的RT-PCR檢測(cè)

        郭杰1,2吳小平1
        (1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福州 350002;2.三門峽農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,三門峽 472000)

        香菇病毒HKB(Lentinula edodes mycovirus HKB,LeV)是一種具有潛隱性特點(diǎn)的真菌病毒,廣泛存在于香菇菌株中。為了快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出LeV,根據(jù)LeV病毒基因組序列(AB.429556.2)的信息,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,對(duì)25個(gè)香菇菌株進(jìn)行RTPCR檢測(cè),在20個(gè)香菇菌株中分別擴(kuò)增出LeV病毒基因組特有的條帶,在5個(gè)香菇菌株中未能擴(kuò)增出條帶。通過對(duì)25個(gè)香菇菌株進(jìn)行dsRNA提取檢測(cè),結(jié)果也表明不存在擴(kuò)增片段的菌株提取不到dsRNA,存在擴(kuò)增片段的菌株能夠提取得到dsRNA。因此建立的RT-PCR方法可以快速檢測(cè)到香菇dsRNA病毒LeV,能夠?qū)ο愎降馁|(zhì)量檢測(cè)提供技術(shù)支持。

        dsRNA 真菌病毒 RT-PCR 香菇

        香菇病毒HKB(Lentinula edodesmycovirus HKB,LeV),存在于多數(shù)感染病毒的香菇中。最近有報(bào)道檢測(cè)到一條與其基因組相關(guān)的dsRNA,分子大小為11 282 bp,編碼兩個(gè)閱讀框ORF1和ORF2,ORF1編碼一個(gè)假定蛋白,ORF2推測(cè)編碼RNA依賴的RNA聚合酶[1]。LeV是一種真菌病毒,具有潛隱性的特點(diǎn),在生產(chǎn)過程中人們不易辯認(rèn)和排除[2]。通常感染病毒的香菇可以完成自身正常的生命周期,病毒在很長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生明顯的癥狀,但也會(huì)偶爾出現(xiàn)異常癥狀。如基質(zhì)表面白色絨毛菌絲生長(zhǎng)不足或轉(zhuǎn)色不完全[3],子實(shí)體畸型等,這些癥狀往往導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,為滿足香菇菌株質(zhì)量檢測(cè)和無(wú)毒化生產(chǎn)的需要,本試驗(yàn)根據(jù)LeV基因序列,擬建立快速、簡(jiǎn)單的RT-PCR方法用于香菇病毒LeV感染的檢測(cè)診斷。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 供試菌株 香菇菌株236,Cr33,慶科20,春菇一號(hào),香安,9319,L0200,L0205,L0213,L0228,L0232,L0284,L0312,L0318,L0327,L0328,L0334,L0364,L0368,L0391,L0610,L0612,L0617,L0620,感染LeV的菌株L0183[4]均為福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心保存。

        1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖

        20 g,瓊脂20 g,水1 000 mL。

        PDB培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,H2O 1 000 mL。

        1.1.3 主要試劑 RT試劑,DNaseⅠ和S1 Nuclease購(gòu)自Fermentas公司;PCR試劑,pMD18-T,E.coliDH5α購(gòu)自TaKaRa公司;Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)。根據(jù)LeV的ORF2序列信息(GenBank:AB.429556.2)設(shè)計(jì)1對(duì)引物:LeVY-02-S:5'-ACAGTAGCGGTATCTCA-3',LeVY-02-A:5'-GCCAGGCAGTTTAGT-3'。

        1.2 方法

        1.2.1 菌絲體的制備 供試香菇菌種轉(zhuǎn)接于試管中活化(含PDA培養(yǎng)基),滿管后轉(zhuǎn)接于500 mL三角瓶中(含200 mL PDB培養(yǎng)基),25℃下靜置培養(yǎng)15 d,過濾收集菌絲體,用濾紙吸干,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 香菇dsRNA和RNA的提取 供試菌株dsRNA和RNA的提取方法分別參照dsRNA技術(shù)[4]和Trizol試劑盒操作說(shuō)明書。

        1.2.3 香菇dsRNA病毒RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系 RT反應(yīng)體系,首先在0.2 mL PCR管中加入RNA模版(100 ng),10 μmol/L引物L(fēng)eVY-02-A 1 μL,二甲亞砜1 μL,補(bǔ)DEPC水至10 μL,100℃保溫5 min,然后迅速放置冰上5 min。再添加5×RT Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、40 U/μL Rnase inhibitor 0.5 μL、200 U/μL 反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV 0.5 μL、用DEPC水補(bǔ)充至20 μL,反應(yīng)總體積為20 μL,反應(yīng)程序?yàn)?2℃反應(yīng)1 h,70℃滅活10 min立刻置于冰上,-20℃保存。

        RT反應(yīng)結(jié)束后取1 μL RT產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng),添加10×PCR Buffer 3 μL(含15 mmol/L MgCl2),2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μLTaqDNA聚合酶 0.3 μL、10 μmol/L引物(LeVY-02-S,LeVY-02-A)各1 μL,用DEPC水補(bǔ)充至30 μL,反應(yīng)總體積為30 μL,反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min,95℃ 45 s,最佳退火溫度52℃ 45 s,72℃ 45 s,25個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。

        1.2.4 病毒核酸類型鑒定 利用DNaseⅠ和S1 Nuclease鑒定該病毒基因組的核酸類型,分別參照DNaseⅠ和S1 Nuclease的操作說(shuō)明書。

        1.2.5 RT-PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物后,隨機(jī)選取3個(gè)菌株擴(kuò)增的目的片段經(jīng)PCR Fragment Recover Kit回收純化,與pMD18-T Vector連接后轉(zhuǎn)化E.coli.DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性克隆子,菌落PCR驗(yàn)證后,送上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果運(yùn)用NCBI Blast進(jìn)行同源性搜索比較分析。

        2 結(jié)果

        2.1 RT-PCR檢測(cè)

        LeVY-02引物RT-PCR結(jié)果(圖1)表明,在25個(gè)香菇菌株中,236、L0200、L0328、L0284、L0620菌株不存在特異性目的片段,其余菌株均存在一條大小約434 bp的特異性目的片段。因此,236、L0200、L0328、L0284、L0620菌株中不含有香菇真菌病毒,其余20個(gè)菌株中可能含有香菇真菌病毒LeV。

        圖1 RT-PCR檢測(cè)香菇真菌病毒LeV的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

        2.2 序列分析

        L0183、L0232、L0617菌株RT-PCR擴(kuò)增的目的片段克隆測(cè)序后,結(jié)果(圖2)表明3個(gè)片段的序列分別與LeV(AB.429556.2)對(duì)應(yīng)序列的相似性為 98%(L0232)、99%(L0183)、99%(L0617)。由此,可以認(rèn)為存在擴(kuò)增片段的20個(gè)菌株中含有香菇真菌病毒LeV,但其dsRNA可能有差異。

        圖2 多序列比對(duì)結(jié)果

        2.3 病毒核酸類型

        經(jīng)過DNaseⅠ和S1 Nuclease鑒定該病毒基因組的核酸類型為dsRNA(圖3)。通過dsRNA的提取結(jié)果也表明不存在擴(kuò)增片段的菌株提取不到dsRNA,存在擴(kuò)增片段的菌株能夠提取得到dsRNA。

        圖3 香菇真菌病毒LeV基因組瓊脂糖凝膠電泳

        3 討論

        通常dsRNA病毒可以通過電子顯微鏡進(jìn)行病毒顆粒的檢測(cè)[5-8],但是電鏡檢測(cè)需要的樣品量大,過程復(fù)雜且靈敏度相對(duì)較低,對(duì)于一些特殊的病毒,電鏡也無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。已有研究表明,LeV是一種線性真菌病毒,通過電子顯微鏡沒有發(fā)現(xiàn)同dsRNA相關(guān)的病毒顆粒,通過原子力顯微鏡才獲得了病毒的分子成像[1],但昂貴的設(shè)備,更高要求的檢測(cè)方法令一般的研究單位難以負(fù)擔(dān)。dsRNA病毒還可以通過提取病毒基因組進(jìn)行檢測(cè)[9-11],但傳統(tǒng)的dsRNA提取技術(shù)檢測(cè)香菇病毒,經(jīng)常性地出現(xiàn)雜帶影響或提取不到dsRNA[4]。RT-PCR檢測(cè)是一種常規(guī)的檢測(cè)技術(shù),在動(dòng)植物病毒檢測(cè)方面已有多篇報(bào)道[12-14],在食用菌dsRNA病毒檢測(cè)中也有相關(guān)報(bào)道[15,16],但在國(guó)內(nèi)尚未見利用RT-PCR對(duì)香菇病毒HKB(LeV)檢測(cè)的報(bào)道。經(jīng)過LeV的RT-PCR檢測(cè)試驗(yàn)證實(shí),RT-PCR方法較其他檢測(cè)方法,不需要特殊且貴重的儀器設(shè)備,也無(wú)需活性病毒,只要存在未降解的核酸片段,且達(dá)到檢測(cè)的最低病毒量就

        能夠檢測(cè),具有操作簡(jiǎn)單,快速、靈敏性高的特點(diǎn),可以避免提取病毒顆粒和基因組等檢測(cè)方法操作繁瑣或效果不理想等問題。

        香菇LeV病毒RT-PCR檢測(cè)方法還需要繼續(xù)完善,如進(jìn)行RT-PCR方法的優(yōu)化試驗(yàn),提高檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)性;或開發(fā)具有熒光素標(biāo)記或其他發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的RT-PCR,提高檢測(cè)結(jié)果的可視性;或在香菇病毒分子生物學(xué)的深入研究下,完成病毒基因組的全序列分析,建立核酸分子雜交檢測(cè)方法,免疫學(xué)血清檢測(cè)方法,酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法和蛋白質(zhì)微列陣檢測(cè)方法等,開發(fā)出簡(jiǎn)便、靈敏的病毒檢測(cè)試紙條,無(wú)論是在研究上或應(yīng)用上都具有廣泛的現(xiàn)實(shí)意義。

        4 結(jié)論

        建立了一種可對(duì)香菇LeV病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增的RT-PCR方法,適用于香菇LeV病毒的診斷和快速檢測(cè)。

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        (責(zé)任編輯 李楠)

        RT-PCR Detection of dsRNA Virus LeV in Lentinula edodes

        Guo Jie1,2Wu Xiaoping1
        (1. College of Life Science,F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University,F(xiàn)uzhou 350002;2. Institute of SanMenxia Agriculture Science,Sanmenxia 472000)

        Lentinula edodes mycovirus HKB(LeV)is a fungal virus with the potential symptoms and exists widely in Lentinula edodes strains. In order to detect LeV from abundant strains rapidly and accurately, a pair of primers were designed according to the sequence of LeV(AB.429556.2)and amplified by RT-PCR method. In a total of 25 strains, 20 strains were positive for LeV and 5 strains were negative. The result of dsRNA extraction also showed dsRNA were obtained in the positive strains and the negative strains were not. In conclusion, the study proved that RT-PCR is a rapid and sensitive method for detection of LeV in Lentinula edodes strains and can attribute to the control of strains quality.

        dsRNA Mycovirus RT-PCR Lentinula edodes

        2013-09-23

        福建省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013J01080)

        郭杰,男,助理農(nóng)藝師,碩士,研究方向:食用菌病害;E-mail:gjfywx_2008@163.com

        吳小平,男,教授,博士,研究方向:食用菌教學(xué)與科研;E-mail:fjwxp@126.com

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