香菇dsRNA病毒LeV的RT-PCR檢測(cè)

郭杰1，2吳小平1
（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.三門峽農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，三門峽 472000）

香菇病毒HKB（Lentinula edodes mycovirus HKB，LeV）是一種具有潛隱性特點(diǎn)的真菌病毒，廣泛存在于香菇菌株中。為了快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出LeV，根據(jù)LeV病毒基因組序列（AB.429556.2）的信息，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，對(duì)25個(gè)香菇菌株進(jìn)行RTPCR檢測(cè)，在20個(gè)香菇菌株中分別擴(kuò)增出LeV病毒基因組特有的條帶，在5個(gè)香菇菌株中未能擴(kuò)增出條帶。通過對(duì)25個(gè)香菇菌株進(jìn)行dsRNA提取檢測(cè)，結(jié)果也表明不存在擴(kuò)增片段的菌株提取不到dsRNA，存在擴(kuò)增片段的菌株能夠提取得到dsRNA。因此建立的RT-PCR方法可以快速檢測(cè)到香菇dsRNA病毒LeV，能夠?qū)ο愎降馁|(zhì)量檢測(cè)提供技術(shù)支持。

dsRNA 真菌病毒 RT-PCR 香菇

香菇病毒HKB（Lentinula edodesmycovirus HKB，LeV），存在于多數(shù)感染病毒的香菇中。最近有報(bào)道檢測(cè)到一條與其基因組相關(guān)的dsRNA，分子大小為11 282 bp，編碼兩個(gè)閱讀框ORF1和ORF2，ORF1編碼一個(gè)假定蛋白，ORF2推測(cè)編碼RNA依賴的RNA聚合酶［1］。LeV是一種真菌病毒，具有潛隱性的特點(diǎn)，在生產(chǎn)過程中人們不易辯認(rèn)和排除［2］。通常感染病毒的香菇可以完成自身正常的生命周期，病毒在很長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生明顯的癥狀，但也會(huì)偶爾出現(xiàn)異常癥狀。如基質(zhì)表面白色絨毛菌絲生長(zhǎng)不足或轉(zhuǎn)色不完全［3］，子實(shí)體畸型等，這些癥狀往往導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，為滿足香菇菌株質(zhì)量檢測(cè)和無(wú)毒化生產(chǎn)的需要，本試驗(yàn)根據(jù)LeV基因序列，擬建立快速、簡(jiǎn)單的RT-PCR方法用于香菇病毒LeV感染的檢測(cè)診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 香菇菌株236，Cr33，慶科20，春菇一號(hào)，香安，9319，L0200，L0205，L0213，L0228，L0232，L0284，L0312，L0318，L0327，L0328，L0334，L0364，L0368，L0391，L0610，L0612，L0617，L0620，感染LeV的菌株L0183［4］均為福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖

20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

PDB培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 000 mL。

1.1.3 主要試劑 RT試劑，DNaseⅠ和S1 Nuclease購(gòu)自Fermentas公司；PCR試劑，pMD18-T，E.coliDH5α購(gòu)自TaKaRa公司；Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)。根據(jù)LeV的ORF2序列信息（GenBank：AB.429556.2）設(shè)計(jì)1對(duì)引物：LeVY-02-S：5'-ACAGTAGCGGTATCTCA-3'，LeVY-02-A：5'-GCCAGGCAGTTTAGT-3'。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體的制備 供試香菇菌種轉(zhuǎn)接于試管中活化（含PDA培養(yǎng)基），滿管后轉(zhuǎn)接于500 mL三角瓶中（含200 mL PDB培養(yǎng)基），25℃下靜置培養(yǎng)15 d，過濾收集菌絲體，用濾紙吸干，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 香菇dsRNA和RNA的提取 供試菌株dsRNA和RNA的提取方法分別參照dsRNA技術(shù)［4］和Trizol試劑盒操作說(shuō)明書。

1.2.3 香菇dsRNA病毒RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系 RT反應(yīng)體系，首先在0.2 mL PCR管中加入RNA模版（100 ng），10 μmol/L引物L(fēng)eVY-02-A 1 μL，二甲亞砜1 μL，補(bǔ)DEPC水至10 μL，100℃保溫5 min，然后迅速放置冰上5 min。再添加5×RT Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、40 U/μL Rnase inhibitor 0.5 μL、200 U/μL 反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV 0.5 μL、用DEPC水補(bǔ)充至20 μL，反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?2℃反應(yīng)1 h，70℃滅活10 min立刻置于冰上，-20℃保存。

RT反應(yīng)結(jié)束后取1 μL RT產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，添加10×PCR Buffer 3 μL（含15 mmol/L MgCl2），2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μLTaqDNA聚合酶 0.3 μL、10 μmol/L引物（LeVY-02-S，LeVY-02-A）各1 μL，用DEPC水補(bǔ)充至30 μL，反應(yīng)總體積為30 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃ 45 s，最佳退火溫度52℃ 45 s，72℃ 45 s，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.4 病毒核酸類型鑒定 利用DNaseⅠ和S1 Nuclease鑒定該病毒基因組的核酸類型，分別參照DNaseⅠ和S1 Nuclease的操作說(shuō)明書。

1.2.5 RT-PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物后，隨機(jī)選取3個(gè)菌株擴(kuò)增的目的片段經(jīng)PCR Fragment Recover Kit回收純化，與pMD18-T Vector連接后轉(zhuǎn)化E.coli.DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆子，菌落PCR驗(yàn)證后，送上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果運(yùn)用NCBI Blast進(jìn)行同源性搜索比較分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)

LeVY-02引物RT-PCR結(jié)果（圖1）表明，在25個(gè)香菇菌株中，236、L0200、L0328、L0284、L0620菌株不存在特異性目的片段，其余菌株均存在一條大小約434 bp的特異性目的片段。因此，236、L0200、L0328、L0284、L0620菌株中不含有香菇真菌病毒，其余20個(gè)菌株中可能含有香菇真菌病毒LeV。

圖1 RT-PCR檢測(cè)香菇真菌病毒LeV的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2 序列分析

L0183、L0232、L0617菌株RT-PCR擴(kuò)增的目的片段克隆測(cè)序后，結(jié)果（圖2）表明3個(gè)片段的序列分別與LeV（AB.429556.2）對(duì)應(yīng)序列的相似性為 98%（L0232）、99%（L0183）、99%（L0617）。由此，可以認(rèn)為存在擴(kuò)增片段的20個(gè)菌株中含有香菇真菌病毒LeV，但其dsRNA可能有差異。

圖2 多序列比對(duì)結(jié)果

2.3 病毒核酸類型

經(jīng)過DNaseⅠ和S1 Nuclease鑒定該病毒基因組的核酸類型為dsRNA（圖3）。通過dsRNA的提取結(jié)果也表明不存在擴(kuò)增片段的菌株提取不到dsRNA，存在擴(kuò)增片段的菌株能夠提取得到dsRNA。

圖3 香菇真菌病毒LeV基因組瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

通常dsRNA病毒可以通過電子顯微鏡進(jìn)行病毒顆粒的檢測(cè)［5-8］，但是電鏡檢測(cè)需要的樣品量大，過程復(fù)雜且靈敏度相對(duì)較低，對(duì)于一些特殊的病毒，電鏡也無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。已有研究表明，LeV是一種線性真菌病毒，通過電子顯微鏡沒有發(fā)現(xiàn)同dsRNA相關(guān)的病毒顆粒，通過原子力顯微鏡才獲得了病毒的分子成像［1］，但昂貴的設(shè)備，更高要求的檢測(cè)方法令一般的研究單位難以負(fù)擔(dān)。dsRNA病毒還可以通過提取病毒基因組進(jìn)行檢測(cè)［9-11］，但傳統(tǒng)的dsRNA提取技術(shù)檢測(cè)香菇病毒，經(jīng)常性地出現(xiàn)雜帶影響或提取不到dsRNA［4］。RT-PCR檢測(cè)是一種常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)，在動(dòng)植物病毒檢測(cè)方面已有多篇報(bào)道［12-14］，在食用菌dsRNA病毒檢測(cè)中也有相關(guān)報(bào)道［15，16］，但在國(guó)內(nèi)尚未見利用RT-PCR對(duì)香菇病毒HKB（LeV）檢測(cè)的報(bào)道。經(jīng)過LeV的RT-PCR檢測(cè)試驗(yàn)證實(shí)，RT-PCR方法較其他檢測(cè)方法，不需要特殊且貴重的儀器設(shè)備，也無(wú)需活性病毒，只要存在未降解的核酸片段，且達(dá)到檢測(cè)的最低病毒量就

能夠檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單，快速、靈敏性高的特點(diǎn)，可以避免提取病毒顆粒和基因組等檢測(cè)方法操作繁瑣或效果不理想等問題。

香菇LeV病毒RT-PCR檢測(cè)方法還需要繼續(xù)完善，如進(jìn)行RT-PCR方法的優(yōu)化試驗(yàn)，提高檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)性；或開發(fā)具有熒光素標(biāo)記或其他發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的RT-PCR，提高檢測(cè)結(jié)果的可視性；或在香菇病毒分子生物學(xué)的深入研究下，完成病毒基因組的全序列分析，建立核酸分子雜交檢測(cè)方法，免疫學(xué)血清檢測(cè)方法，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法和蛋白質(zhì)微列陣檢測(cè)方法等，開發(fā)出簡(jiǎn)便、靈敏的病毒檢測(cè)試紙條，無(wú)論是在研究上或應(yīng)用上都具有廣泛的現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

建立了一種可對(duì)香菇LeV病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增的RT-PCR方法，適用于香菇LeV病毒的診斷和快速檢測(cè)。

［1］ Yumi M. Molecular characterization of a novel mycovirus in the cultivated mushroom, Lentinula edodes［J］. Virology Journal, 2012, 9：60.

［2］ 潘迎捷, 陳明杰, 沈雪仁. 香菇病毒的分離、診斷、侵染途徑和生物學(xué)特性［J］. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1992, 8（4）：7-11.

［3］ Ohta C, Taguchi T, Takahashi S, et al. Detection of double stranded RNA elements in cultivated Lentinula edodes（in Japanese）［J］. Mushroom Sci Biotechnol, 2008, 16：155-158.

［4］ 吳小平, 王麗, 謝寶貴, 陳劍, 香菇菌株的脫毒研究［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009, 25（24）：44-49.

［5］ Kim YJ, Kim JY, Kim JH, et al. Identification of a Novel Pleurotus ostreatus dsRNA virus and determination of the distribution of viruses in mushroom spores［J］. The Journal of Microbiology, 2008, 46（1）：95-99.

［6］ Jea YH, Sun LJ, Joo LN, et al. Identification of three isometric viruses from Pleurotus ostreatus［J］. Journal of Huazhong Agricultural University, 2004, 23（1）：150-156.

［7］ Magae Y, Hayashi N. Double-stranded RNA and virus-like particles in the edible basidiomycete Flammulina velutipes（Enokitake）［J］. FEMS Microbiol Lett, 1999, 180（2）：331-335.

［8］ 姚立, 陳春樂, 張忠信, 等. 一種新香菇病毒基因組部分cDNA序列及病毒RT-PCR檢測(cè)［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2010, 37（1）：61-70.

［9］ Gildow EF, Ballinger ME, Rochow WF. Identification of doublestranded RNAS associated with barley yellow dwarf virus infection in oats［J］. Phytopathology, 1983, 73：1570-1572.

［10］ French RC, Price MA, Derrick KS. Circular double-stranded RNA in potato spindle tuber viroid-infected tomatoes［J］. Nature, 1982, 295：259-260.

［11］ Grcgan HM, Aclie BA, Gaze RH, et al. Double-stranded RNA elements associated with the MVX disease of Agaricus bisporus［J］. Mycol Res, 2003, 107（2）：147-154.

［12］ 曹慶, 易干軍, 陳金印, 等. 柑桔裂皮病類病毒RT-PCR檢測(cè)體系優(yōu)化分析［J］. 南昌工程學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 27（03）：64-66.

［13］ 郭立新, 向本春, 朱水芳. 蘋果莖溝病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］. 北方園藝, 2009（3）：8-11.

［14］ 謝志勤, 謝芝勛, 廖敏, 等. RT-PCR檢測(cè)豬瘟病毒方法的建立與應(yīng)用［J］. 畜牧與獸醫(yī), 2002, 34（11）：11-14.

［15］ Peter AR, Peter JW. RT-PCR detection of dsRNAs associated with La France disease of the cultivated mushroom Agaricus bisporus（Lange）Imbach［J］. Journal of Virological Methods, 1997, 63：17-26.

［16］ Kim YJ, Park S, Yie SW, et al. RT-PCR Detection of dsRNA Mycoviruses Infecting Pleurotus ostreatus and Agaricus blazei Murrill［J］. Plant Pathol, 2005, 21（4）：343-348.

（責(zé)任編輯 李楠）

RT-PCR Detection of dsRNA Virus LeV in Lentinula edodes

Guo Jie1，2Wu Xiaoping1
（1. College of Life Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002；2. Institute of SanMenxia Agriculture Science，Sanmenxia 472000）

Lentinula edodes mycovirus HKB（LeV）is a fungal virus with the potential symptoms and exists widely in Lentinula edodes strains. In order to detect LeV from abundant strains rapidly and accurately, a pair of primers were designed according to the sequence of LeV（AB.429556.2）and amplified by RT-PCR method. In a total of 25 strains, 20 strains were positive for LeV and 5 strains were negative. The result of dsRNA extraction also showed dsRNA were obtained in the positive strains and the negative strains were not. In conclusion, the study proved that RT-PCR is a rapid and sensitive method for detection of LeV in Lentinula edodes strains and can attribute to the control of strains quality.

dsRNA Mycovirus RT-PCR Lentinula edodes

2013-09-23

福建省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013J01080）

郭杰，男，助理農(nóng)藝師，碩士，研究方向：食用菌病害；E-mail：gjfywx_2008@163.com

吳小平，男，教授，博士，研究方向：食用菌教學(xué)與科研；E-mail：fjwxp@126.com