中國(guó)番茄黃化曲葉病毒利用根吸收法誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）的初步研究

張召軍 王曉彬 王慧 劉林 張心閣 何秀霞
（長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

以含硫黃素酶Su基因的中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星DNA作為載體，通過(guò)凍融法將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，利用根部吸收法進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉默體系進(jìn)行了優(yōu)化，探討對(duì)病毒誘導(dǎo)基因沉默效率的影響。結(jié)果顯示以O(shè)D600值為1.5的含質(zhì)粒pBinPLUS-2mβ-Su，pBinPLUS-1.7A的農(nóng)桿菌菌液1∶1混合進(jìn)行根部吸收法侵染22-25 d的番茄幼苗，目的基因Su沉默導(dǎo)致番茄幼苗出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，半定量RT- PCR檢測(cè)目的基因Su mRNA被顯著降解，該體系的建立有利于對(duì)植物基因進(jìn)行高通量功能分析。

病毒誘導(dǎo)基因沉默 硫黃素酶Su基因 根吸收法

植物病毒侵染植物體后，植物將啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）進(jìn)行防御，隨著病毒基因組的復(fù)制而沉默掉病毒的某些功能基因。根據(jù)植物的這種防御機(jī)制，可對(duì)植物病毒進(jìn)行改造，使其攜帶植物的內(nèi)源性基因，隨著PTGS的進(jìn)行就可以將內(nèi)源的同源基因沉默，從而引起植物表型變化，進(jìn)一步根據(jù)表型變化來(lái)推測(cè)基因功能，這種利用病毒載體來(lái)使植物內(nèi)源基因沉默的方法被稱為病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VlGS）［1-4］。 國(guó)內(nèi) 外在煙草（Nicotiana tabacum）［5，6］、番茄（Solanum lycopersicum）［7，8］、馬鈴薯（Solanum tuberosum）［9］、辣椒（Capsicum annuum）［10，11］等植物幼苗中已成功建立病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系，但多采用傳統(tǒng)的注射法，該方法會(huì)傷害到植物本身而造成沉默效率較低，不宜對(duì)幼苗進(jìn)行操作，采取根部吸收法可以避免上述缺點(diǎn)。但利用根吸收法誘導(dǎo)基因沉默的研究報(bào)道還比較少［12，13］，為此展開相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄種子由市面上購(gòu)買。大腸桿菌DH5α菌種，農(nóng)桿菌EH101菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存；pBinPLUS-2mβ-Su，pBinPLUS-1.7A質(zhì)粒由浙江大學(xué)周雪平教授惠贈(zèng)。PCR檢測(cè)病毒組分中的1.7A和DNAmβ及Su基因引物參考陶小榮論文［14］。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 將質(zhì)粒pBinPLUS-2mβ-Su，pBinPLUS-1.7A利用凍融法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA101感受態(tài)。轉(zhuǎn)化后涂含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的培養(yǎng)基平板，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。1.2.2 番茄幼苗的培養(yǎng) 番茄種子經(jīng)75%酒精1 min，10%次氯酸鈉15 min滅菌后，播種于1/2MS培養(yǎng)基上。10 d后，將生成的無(wú)菌苗無(wú)土培養(yǎng)，轉(zhuǎn)到人工氣候室中生長(zhǎng)。

1.2.3 根部吸收法侵染番茄幼苗 挑取含pBinPLUS-2mβ-Su，pBinPLUS-1.7A質(zhì)粒的農(nóng)桿菌 EH101單菌落，接種于5 mL含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃過(guò)夜培養(yǎng)。按1∶1的比例混勻，室溫放置2-3 h后，選取農(nóng)桿菌OD600值依次為0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0，對(duì)21株番茄幼苗進(jìn)行侵染效率分析，確定最佳侵染濃度。為了使番茄在侵染期能更好地吸收農(nóng)桿菌菌液，先將要被侵染的番茄幼苗脫水1-2 d。侵染時(shí)，將番茄植株移入到裝滿農(nóng)桿菌菌液4 mL的EP管中，暗室培養(yǎng)24 h，有利于農(nóng)桿菌的侵染，后轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)。沉默癥狀出現(xiàn)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定最佳農(nóng)桿菌侵染濃度。以確定的最佳侵染濃度對(duì)生長(zhǎng)16-40 d的番茄幼苗進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，確定最佳侵染苗齡。

1.2.4 植株基因組DNA提取 在硫黃素酶（Su）基因沉默植株癥狀表現(xiàn)后，1.5 mL的離心管扣取植株頂端的少許新葉，將1 mL 槍頭用酒精燈熔化并凝固成圓頭，充分研磨離心管中的葉片，利用CTAB法提取基因組DNA，溶于20 μL無(wú)菌離子水中。

1.2.5 PCR檢測(cè)基因組DNA中的病毒成分 PCR篩選中國(guó)番茄黃化曲葉病毒誘導(dǎo)的硫黃素酶（Su）基因沉默植株中病毒組分中的1.7A 的引物為PA、PB。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5℃，5 min；95℃，45 s，52℃，30 s，72℃，45 s，35 cycle；72℃，10 min。對(duì)所提取基因組DNA 進(jìn)行病毒組分中DNAmβ的檢測(cè)所用引物為Beta01和Beta02，PCR 擴(kuò)增程序中除72℃，90 s外其余同1.7A擴(kuò)增條件。兩個(gè)PCR 反應(yīng)使用同一體系。組分為：10 ×PCR buffer 2.5 μL：ddH2O 19.3 μL；Taq plus 0.2 μL；引物1（10 pmol/L）1 μL；引物2（10 pmol/L）1 μL；dNTP 0.5 μL；模板質(zhì)粒0.5 μL；終體積為25 μL。

1.2.6 植株總RNA的提取與半定量RT-PCR檢測(cè)根據(jù)Trizol試劑盒提供的操作手冊(cè)進(jìn)行總RNA的提取，提取完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：MgCl22 μL；RNase Free dH2O 3.75 μL；10×RT buffer 1 μL；dNTP Mixture（ 各 10 mmol/L）1 μL；RNase Inhibitor 0.25 μL；AMV Random Transcriptase 0.5 μL；Oligo dTAdaptor Primer 0.5 μL；試驗(yàn)樣品RNA（≤1 μg total RNA）1 μL；終體積為10 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：30℃，10 min；42℃，25 min；99℃，5 min；5℃，5 min；all 1 cycle。以延長(zhǎng)因子-1-α（Elongation factor l-alpha 1 gene，EF-1-α）作為半定量RT-PCR的內(nèi)參。以Su的引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行半定量RTPCR，在15、18、21、24、27和30個(gè)PCR循環(huán)時(shí)分別取出8 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)后凝膠成像。

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)桿菌最佳接種濃度的測(cè)定

對(duì)21株幼苗進(jìn)行不同濃度農(nóng)桿菌侵染效率的分析，結(jié)果（圖1）表明，農(nóng)桿菌的OD600值在1.5時(shí)的沉默效率最高，農(nóng)桿菌的OD600在1.0以下時(shí)沉默效率較低，在大于1.75左右時(shí)對(duì)植物細(xì)胞有一定的毒害作用，導(dǎo)致番茄幼苗萎蔫或者壞死。

圖1 農(nóng)桿菌濃度（OD值）與沉默效率的關(guān)系

2.2 番茄苗齡對(duì)VIGS效率的影響

選擇生長(zhǎng)16-40 d的番茄進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，沉默癥狀（圖2）出現(xiàn)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（圖3）表明番茄幼苗在22-25 d時(shí)，用OD值在1.5附近的農(nóng)桿菌侵染時(shí)，沉默效率可達(dá)84%。

圖2 Su基因沉默癥狀的番茄植株

圖3 番茄苗齡與沉默效率的關(guān)系

2.3 番茄基因組DNA的提取結(jié)果

將樣品直接放入1.5 mL 的離心管中研磨，保證研磨充分。結(jié)果（圖4）顯示提取的DNA有降解，但是不會(huì)影響后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 接種Su 番茄植株基因組DNA.

2.4 PCR檢測(cè)基因組DNA中的病毒成分

以提取的番茄葉片DNA 為模板，擴(kuò)增中國(guó)番茄黃化曲葉病毒誘導(dǎo)的硫黃素酶（Su）基因沉默植株中病毒組分中的DNAmβ（圖5）和1.7A（圖6），片段大小分別為1 300 bp、500 bp。初步表明病毒成分已經(jīng)整合到番茄基因組中，所檢測(cè)含有兩種病毒組分的植株在外觀上都有硫黃素酶（Su）基因沉默的癥狀（植株黃化）表現(xiàn)（圖2）。

圖5 接種Su番茄植株基因組中的DNAmβ組分的Beta 01、Beta 02的PCR鑒定

圖6 接種Su番茄植株基因組中的DNA-A的1.7A片段的P A、P B 的PCR鑒定

2.5 轉(zhuǎn)化植株半定量RT-PCR檢測(cè)

Trizol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果（圖7）顯示，所提取的總RNA完整未降解，有3條電泳帶，從上到下分別為28S，18S和5S。

圖7 總RNA提取結(jié)果

以Su的引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行半定量RT-PCR（圖8），看到未接種植株的Su的表達(dá)量要顯著高于Su基因沉默植株的表達(dá)量，差異顯著。

3 討論

農(nóng)桿菌最佳侵染濃度OD600為1.5左右，高于常規(guī)農(nóng)桿菌侵染菌液為OD600=0.5-1，分析原因可

能的是由于植物不斷生長(zhǎng)，侵染的農(nóng)桿菌菌液濃度略高于常規(guī)的侵染濃度才能達(dá)到整體植物侵染的要求［15］。處于22-25 d的番茄幼苗具有最佳感受農(nóng)桿菌的能力，農(nóng)桿菌侵染要求植物細(xì)胞必須處于感受狀態(tài)（即選擇合適的苗齡），如果植物苗齡過(guò)大，除了番茄的細(xì)胞感受能力下降外，植物的節(jié)間變長(zhǎng)，延長(zhǎng)了病毒沉默信號(hào)傳導(dǎo)的途徑，導(dǎo)致沉默的效率下降。由此可見苗齡對(duì)沉默效率有重要的影響［16］。

圖8 Su基因沉默的番茄植株的半定量RT-PCR檢測(cè)

傳統(tǒng)的注射法是常用的病毒誘導(dǎo)基因沉默的農(nóng)桿菌侵染方法，但這種方法會(huì)傷害到植物本身而造成沉默效率較低，不宜對(duì)幼苗進(jìn)行操作。本試驗(yàn)采取的根部吸收法是通過(guò)植物的根浸潤(rùn)在攜帶有番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星DNA載體的農(nóng)桿菌重懸液中，利用植物本身的傳遞將沉默信號(hào)傳遞到葉莖部，成功地誘導(dǎo)了Su基因沉默，對(duì)植物本身沒(méi)有傷害，可以對(duì)浸潤(rùn)注射無(wú)法接種的更小幼苗進(jìn)行接種，因此適用的植物范圍更廣。例如，Ryu等［17］利用TRV病毒載體通過(guò)根吸收法成功的在本氏煙和其他重要的經(jīng)濟(jì)作物如番茄、辣椒、煙草、矮牽牛等茄科及豆科植物中誘導(dǎo)了八氫番茄紅素脫氫酶PDS基因沉默。為此根吸收法有助于快速大規(guī)模cDNA文庫(kù)分析。

4 結(jié)論

通過(guò)根吸收法進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染誘導(dǎo)番茄植株發(fā)生RNA沉默，該體系的建立有利于對(duì)植物基因進(jìn)行高通量功能分析。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Study on Chinese Tomato Yellow Leaf Curl Virus-induced Gene Silencing（ VIGS） via Root Absorption

Zhang Zhaojun Wang Xiaobin Wang Hui Liu Lin Zhang Xinge He Xiuxia
（College of Life Science，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

The tomato yellow leaf curl virus satellite DNA was used as vector which containing the Su gene, and transformed the plasmid into Agrobacterium by freeze thawing method. Agrobacterium infected plants via root absorption, and virus-induced gene silencing system was optimized, twexplore the influence to virus-induced gene silencing efficiency. The results showed infected 22-25 days tomato seedling via OD6001.5 Agrobacterium-mediated root-absorption which containing plasmid pBinPLUS-2mβ-Su and pBinPLUS-1.7A, the silencing of Su gene resulted in photo-blcached young leaves of tomato plants. Semi-quantitative RT-PCR analysis was employed to test the effect of Su gene silencing, which showed that Su gene was degraed significantly. This gene-silencing system would benefit for the high-throughput analysis of plant gene.

Virus-induced gene silencing Su gene Root absorption method

2013-09-18

大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2012X77），吉林省科技廳項(xiàng)目（20110244）

張召軍，男，生物技術(shù)專業(yè)；E-mail：zhangzhaojunk@qq.com

何秀霞，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：分子生物學(xué)及生物檢測(cè)；E-mail：chinese_hxx@sohu.com