刺五加細(xì)胞色素P450基因的克隆與表達(dá)分析

邢朝斌 吳鵬 李非非 劉巖 周秘 修樂(lè)山
（河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，唐山 063000）

根據(jù)已報(bào)道的人參、三七等植物的細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，P450）基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR法克隆刺五加P450基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并分析其在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和器官中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，克隆了全長(zhǎng)為1 410 bp的刺五加P450基因的cDNA序列，該基因編碼469個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。GenBank登錄號(hào)為KF498590，與人參、三七的P450氨基酸序列一致性分別為91.5%和90.4%。刺五加的P450基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和器官中均有表達(dá)，但表達(dá)量具有顯著差異（P＜0.05）。最大表達(dá)量出現(xiàn)在盛花期，為最低表達(dá)量（萌芽期）的1.26倍。各器官中，葉片的表達(dá)量最高，是最低量幼莖的1.49倍。

刺五加 細(xì)胞色素P450 克隆 表達(dá)分析

刺五加Eleutherococcus senticosus（Rupr.et Maxim）Maxim是我國(guó)傳統(tǒng)的珍貴藥用植物，具有抗腫瘤、抗輻射、提高機(jī)體免疫力等多種藥理作用和生理活性，皂苷類(lèi)化合物為其主要活性成分之一［1］。與其他藥用植物相似，刺五加中的皂苷含量普遍較低。探明三萜類(lèi)化合物的生物合成途徑是利用代謝工程直接合成或通過(guò)基因工程工業(yè)化生產(chǎn)三萜類(lèi)化合物的關(guān)鍵基礎(chǔ)［2］。三萜類(lèi)化合物的生物合成一般分為，前體的合成、形成三萜皂苷骨架和后修飾過(guò)程3個(gè)階段［3］。目前對(duì)三萜類(lèi)合成的分子機(jī)理的研究主要集中在前體合成和形成三萜皂苷骨架階段，而對(duì)決定三萜皂苷種類(lèi)起主要作用的三萜碳環(huán)的復(fù)雜修飾過(guò)程研究較少［4］。細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，P450）是三萜皂苷生物合成后修飾過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，該酶含有血紅素配基，是植物中最大的一個(gè)超基因家族，其不同家族成員參與了多種植

物的次生代謝途徑［5］。目前僅見(jiàn)少數(shù)幾個(gè)參與三萜皂苷生物合成的P450基因的報(bào)道［4］。因此克隆刺五加P450基因的全長(zhǎng)序列，并分析其在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同器官中的表達(dá)規(guī)律，對(duì)深入研究P450基因在刺五加皂苷生物合成中的作用機(jī)制和表達(dá)調(diào)控具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試刺五加采自黑龍江省雞西市，經(jīng)河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院邢朝斌副教授鑒定。分別以4-9月的葉和8月的根、莖、葉片和葉柄（編號(hào)為1-10）為提取總RNA的試材。

1.1.2 試劑 RevertAidTMFirst strand cDNA synthesis Kit購(gòu)自Thermo公司。質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自Biomiga公司。TOP10感受態(tài)細(xì)胞、PGM-T克隆試劑盒和植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。TaqDNA聚合酶和LATaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司。X-Gal、IPTG、dNTPs、異硫氰酸胍購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PAGE純化。

1.2 方法

1.2.1 刺五加總RNA的提取與P450基因的獲得 根據(jù)植物總RNA提取試劑盒的說(shuō)明，分別提取1-10號(hào)刺五加樣本的總RNA，并參照RevertAidTMFirst strand cDNA synthesis Kit的說(shuō)明，以2 μL的總RNA為模板，將上述樣本分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用根據(jù)GenBank登錄的與刺五加同科的人參（JX036031）、三七（GU997670）的P450基因序列設(shè)計(jì)的上游引物P4501S1：5'- ATGGATCTCTTTATCTCATC -3'和下游引物P4501X1：5'- ATGGATCTCTTTATCTCATC -3'，以逆轉(zhuǎn)錄獲得的刺五加葉片cDNA為模板，PCR擴(kuò)增刺五加P450基因的cDNA序列。反應(yīng)體系50 μL，其中上下游引物各1 μL，10×LATaqBuffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，模板cDNA 2 μL，LATaqDNA聚合酶0.6 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃、3 min；變性94℃、30 s；退火50℃、30 s；延伸72℃、1 min 40 s。35個(gè)循環(huán)后72℃補(bǔ)充延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳、回收、克隆入PGM-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后，送Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.2 刺五加P450基因的生物信息學(xué)分析 參照邢朝斌等［6］的方法，利用MotifScan、ProtParam、ProtScale、SOPMA和TMHMM 2.0等在線(xiàn)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用MEGA 5.21軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 刺五加P450基因的表達(dá)分析 以逆轉(zhuǎn)錄獲得的1-10號(hào)的刺五加cDNA為模板，參照文獻(xiàn)［6］的方法，利用預(yù)計(jì)擴(kuò)增P450基因長(zhǎng)度為139 bp的上游引物P450RTS：5'- TGGGTATCCAAAGAAGCAGG-3'，下游引物P450RTX：5'-CAGCCAAGCCGAGTAGAGC -3'，和預(yù)計(jì)擴(kuò)增刺五加GAPDH基因長(zhǎng)度為134 bp的引物RGS和RGX［6］，進(jìn)行表達(dá)量分析。

2 結(jié)果

2.1 刺五加P450基因的克隆與鑒定

利用引物P4501S1和P4501X1，RT-PCR擴(kuò)增刺五加的cDNA，測(cè)序獲得長(zhǎng)1 410 bp的片段（圖1），與預(yù)期長(zhǎng)度相符。將擴(kuò)增片段重組入PGM-T Vector后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與刺五加總RNA的RTPCR產(chǎn)物大小相等。

圖1 刺五加P450基因的克隆

2.2 刺五加P450基因的生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果表明，所獲得的刺五加P450基因cDNA的長(zhǎng)度為1 410 bp，上游為起始密碼子ATG，下游為終止密碼子TAA，推測(cè)其編碼469個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，GenBank登錄號(hào)為KF498590。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53.083 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.62。

通過(guò)NCBI的BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，刺五加P450蛋白與已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能數(shù)據(jù)庫(kù)中其他物種的

P450具有相似的結(jié)構(gòu)功能域。刺五加P450的409-418位的氨基酸［FGGGPRMCPG］為P450家族的典型保守結(jié)構(gòu)域，27-466位的氨基酸為P450的標(biāo)志性序列。通過(guò)TMHMM軟件分析得知，刺五加P450蛋白的5-21和276-292位氨基酸處存在跨膜螺旋，定位于線(xiàn)粒體。運(yùn)用SOPMA軟件預(yù)測(cè)刺五加P450蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果表明，該蛋白含有222個(gè)α螺旋，占47.33%；61個(gè)延伸鏈，占13.01%；18個(gè)β折疊，占3.84%；168個(gè)無(wú)規(guī)則蜷曲，占35.82%。

2.3 P450的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA軟件，將GenBank中登載的12個(gè)物種的P450蛋白與刺五加的P450蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建P450蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。刺五加與同為五加科的人參、三七和西洋參的親緣關(guān)系最近，首先聚為一支，可信度達(dá)100%，之后與其他雙子葉植物聚為一個(gè)大的分支，單子葉植物和裸子植物單獨(dú)聚為一個(gè)分支，之后與人類(lèi)聚在一起。

圖2 P450氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 刺五加P450基因的表達(dá)分析

刺五加P450基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和器官中的表達(dá)量變化如圖3所示。自萌芽后的整個(gè)生長(zhǎng)期中，P450基因均有表達(dá)，但表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）。在整個(gè)生長(zhǎng)期中，P450的表達(dá)呈現(xiàn)先低后高的變化趨勢(shì)。萌芽期（4月26日）的表達(dá)量最低，之后顯著升高，進(jìn)入盛花期（6月26日）至葉片衰老期（9月26日）后，P450的表達(dá)量始終維持在較高水平。其中盛花期（6月26日）的表達(dá)量最高，是最低表達(dá)量萌芽期的1.26倍，但盛花期、果實(shí)快速生長(zhǎng)期（7月26日）、果實(shí)基本成熟期（8月26日）和葉片衰老期的表達(dá)量間差異未達(dá)顯著水平。

刺五加的P450基因在葉片、葉柄、幼莖和根中均有表達(dá)，但表達(dá)量具有顯著差異（P＜0.05）（圖3）。葉片中的表達(dá)量最高，葉柄次之，分別為最低表達(dá)量（幼莖）的1.49和1.24倍，幼莖和根中的表達(dá)量間差異不顯著。

圖3 刺五加不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期及器官中P450基因的表達(dá)變化

3 討論

細(xì)胞色素P450基因是一個(gè)古老的超基因家族，其編碼蛋白為植物中最大的酶蛋白家族，在植物體內(nèi)擔(dān)當(dāng)著重要的功能［7］。在所有已知結(jié)構(gòu)的P450中都存在一個(gè)保守的血紅素結(jié)合域，含有保守的FxxGxRxCxG序列，該序列是鑒定P450的主要特征，其中的半胱氨酸（C）是亞鐵血紅素的第5個(gè)軸配體，在所有的P450 中完全保守［7，8］。本試驗(yàn)所克隆出的刺五加P450基因的編碼蛋白409-418位的氨基酸為［FGGGPRMCPG］，與上述特征完全相符。氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果顯示，刺五加P450的氨基酸序列與人參（Panax ginseng）、三七（P. notoginseng）、西洋參（P. quinquefolius）和丹參（Salvia miltiorrhiza）的一致性分別達(dá)到91.5%、90.4%、89.3%和70.6%，依據(jù)“2個(gè)P450的氨基酸序列一致性如果大于

55%，則它們屬于同一個(gè)亞家族”的原則［7］，初步判定刺五加的P450屬于P450家族中調(diào)控三萜皂苷類(lèi)化合物形成的CPY85亞家族［9-11］。同時(shí)，依據(jù)P450的氨基酸序列進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果也與傳統(tǒng)的分類(lèi)結(jié)果相一致。

刺五加P450基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和器官中表達(dá)量的分析結(jié)果表明，刺五加的P450基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和葉片、葉柄、幼莖和根中均有表達(dá)，其表達(dá)量隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行逐漸上升，其中，盛花期的葉中的表達(dá)量最高。這與甘草［12］和蒺藜苜蓿［13］P450基因的表達(dá)特點(diǎn)相似。所不同的是甘草和蒺藜苜蓿的P450恒定高表達(dá)于根器官中，而刺五加中則為葉片中表達(dá)量最高，這與甘草［12］和蒺藜苜蓿［13］中皂苷類(lèi)化合物主要存在于根，刺五加則主要存在于葉片中［1］的特點(diǎn)相符，這預(yù)示著P450在刺五加三萜皂苷類(lèi)化合物的次生代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

4 結(jié)論

刺五加P450基因編碼的蛋白與五加科其他植物P450的氨基酸序列一致性最高，并具有P450基因家族的典型特征序列。

刺五加的P450基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和器官中均有表達(dá)，但表達(dá)量具有顯著差異。

［1］ 涂正偉, 周渭渭, 單淇, 等. 刺五加的研究進(jìn)展［J］. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2011, 34（3）：213-216.

［2］ 趙云生, 萬(wàn)德光, 陳新, 等. 五環(huán)三萜皂苷生物合成與調(diào)控的研究進(jìn)展［J］. 中草藥, 2009, 40（2）：327-330.

［3］ 隋春, 徐潔森, 趙立子, 等. 北柴胡UGT基因的克隆及其過(guò)量表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建［J］. 中國(guó)中藥雜志, 2012（5）：558-563.

［4］ 徐潔森, 魏建和, 趙立子, 等. 北柴胡細(xì)胞色素P450酶基因的克隆及其植物過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建［J］. 生物技術(shù)通訊, 2012, 23（4）：537-541.

［5］ Brazier M, Cole DJ, Edwards R. O-Glucosyltransferase activities toward phenolic natural products and xenobiotics in wheat and herbicide-resistant and herbicide-susceptible black-grass（Alopecurus myosuroides）［J］. Phytochemistry, 2002, 59（2）：149-156.

［6］ 邢朝斌, 龍?jiān)录t, 何閃, 等. 刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息學(xué)及表達(dá)分析［J］. 中國(guó)中藥雜志, 2012, 37（12）：1725-1730.

［7］ 賀麗虹, 趙淑娟, 胡之璧. 植物細(xì)胞色素P450基因與功能研究進(jìn)展［J］. 藥物生物技術(shù), 2008, 15（2）：142-147.

［8］ Rupasinghe S, Schuler M. Homology modeling of plant cytochrome P450s［J］. Phytochem Rev, 2006, 5（2-3）：473-505.

［9］ Han JY, Hwang HS, Choi SW, et al. Cytochrome P450 CYP716A53v2 catalyzes the formation of protopanaxatriol from protopanaxadiol during ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng［J］. Plant Cell Physiol, 2012, 53（9）：1535-1545.

［10］ Luo H, Sun C, Sun Y, et al. Analysis of the transcriptome of Panax notoginseng root uncovers putative triterpene saponin-biosynthetic genes and genetic markers［J］. BMC Genomics, 2011, 12（S5）：1-15.

［11］ Sui C, Zhang J, Wei J, et al. Transcriptome analysis of Bupleurum chinense focusing on genes involved in the biosynthesis of saikosaponins［J］. BMC Genomics, 2011, 12：539.

［12］ Seki H, Sawai S, Ohyama K, et al. Triterpene functional genomics in licorice for identification of CYP72A154 involved in the biosynthesis of glycyrrhizin［J］. Plant Cell, 2011, 23（11）：4112-4123.

［13］ Carelli M, Biazzi E, Panara F, et al. Medicago truncatula CYP716A12 is a multifunctional oxidase involved in the biosynthesis of hemolytic saponins［J］. Plant Cell, 2011, 23（8）：3070-3081.

（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Cytochrome P450 Gene in Eleutherococcus senticosus

Xing Zhaobin Wu Peng Li Feifei Liu Yan Zhou Mi Xiu Leshan
（College of Life Science，Hebei United University，Tangshan 063000）

In order to clone cytochrome P450（P450）in Eleutherococcus senticosus, the primers were designed according to cDNA of the reported Panax ginseng and P. notoginseng. The full length cDNA of the E. senticosus P450 was cloned by RT-PCR, and analyzed the expression of P450 in different growth periods and organs of E. senticosus. The results showed that the full length of P450 was 1 410 bp, encoded a protein with 469 amino-acid residues, GenBank accession number KF498590. To compare the amino acid sequence of E.senticosus P450 with P. ginseng and P. notoginseng, the amino acid homology was 91.5% and 90.4%. P450 expressed in different growth periods and organs of E. senticosus, and the expression amount differed significantly（P＜0.05）. The highest content of the expression showed up when full opening flower stage, which was 1.26 times as much as that in the lowest at germination stage. The highest content of the expression was in the leaves which was 1.49 times as much as that of the lowest in young stem.

Eleutherococcus senticosus Cytochrome P450 Cloning Expression analysis

2013-09-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30701086），河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2009001252），河北省自然科學(xué)基金-石藥集團(tuán)醫(yī)藥聯(lián)合研究基金項(xiàng)目（H2012401006），河北聯(lián)合大學(xué)培育基金項(xiàng)目（GP201306）

邢朝斌，男，副教授，研究方向：分子生藥學(xué)、藥用植物細(xì)胞工程；E-mail：xzbheuu@126.com