董紅敏，李素清，牛小勇，沈麗雯，李 路，秦 文，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014；2.閬中縣供銷合作社，四川閬中637400）

正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化川明參多糖超聲提取工藝

董紅敏1，李素清1，牛小勇2，沈麗雯1，李 路1，秦 文1，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014；2.閬中縣供銷合作社，四川閬中637400）

研究超聲波水提醇沉法提取川明參多糖的最佳工藝。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量，考察料液比、超聲提取溫度、超聲功率、超聲作用時(shí)間和超聲提取次數(shù)對(duì)川明參多糖提取率的影響。得出影響川明參多糖提取率的先后次序?yàn)椋毫弦罕龋境曁崛囟龋境暪β剩境曌饔脮r(shí)間。最佳提取工藝條件為溫度70℃，超聲功率140W，料液比1∶40，提取時(shí)間45min，提取2次。該工藝條件下，川明參多糖的平均提取率為47.13%。

川明參，超聲提取，多糖，正交實(shí)驗(yàn)

川明參是傘形科（Umbelliferae）植物川明參屬“chuanminshen violaceum Sheh et Shan”的干燥根，又名明參、明沙參、土明參、沙參，是我國特有的單種屬植物，是四川產(chǎn)道地藥材。具有滋陰補(bǔ)肺，健脾等功效，主治熱病傷陰，肺熱咳嗽，脾虛食少，病后體弱[1-2]。川明參中含有多糖、香豆素、黃酮、甾醇、蛋白質(zhì)和氨基酸、有機(jī)酸、酚類等化學(xué)成分[3]。其中多糖含量最高。已有的研究表明川明參多糖具有抗突變作用，鎮(zhèn)咳、祛痰，免疫調(diào)節(jié)作用，抗疲勞、抗氧化作用以及抗病毒作用等[4-7]，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域，市場(chǎng)前景廣闊，因此高效提取川明參多糖具有重要意義。

目前，對(duì)川明參多糖提取的研究，主要采用熱水浸提法或熱回流法[8-9]，這些方法具有能耗大，效率低，提取溫度高，容易造成多糖降解，多糖活性降低等缺點(diǎn)。而超聲波提取由于具有簡(jiǎn)單、方便、快速、得率高且不影響有效成分等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用到植物活性成分的提取中[10]。而有關(guān)川明參多糖超聲提取的研究尚未有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波法提取川明參多糖，用苯酚-硫酸比色法對(duì)川明參多糖進(jìn)行含量測(cè)定，詳細(xì)研究并優(yōu)化了超聲波法提取川明參多糖的工藝條件，為川明參多糖提取的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮川明參 2013年春由四川閬中供銷社提供；葡萄糖、石油醚、無水乙醇、濃硫酸、苯酚 均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

FW177型中藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-3200型掃描型紫外可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；SC-04型低速離心

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以蒸餾水為提取劑，分別就料液比、超聲溫度、超聲功率、超聲作用時(shí)間和超聲次數(shù)做單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 料液比 固定超聲溫度50℃，超聲功率80W，超聲作用時(shí)間15min，超聲次數(shù)2次，考察不同料液比（g/mL）1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50對(duì)川明參多糖提取率的影響。

1.2.3.2 超聲溫度 固定超聲功率80W，超聲作用時(shí)機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；101-4型恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Heto Power Dry PL3000型凍干機(jī) 美國Thermo Scientific公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 川明參多糖超聲波水提醇沉工藝流程 新鮮川明參→干燥→粉碎→過篩→脫脂、脫色、除小分子糖→干燥→超聲提取→過濾→濃縮→醇沉過夜→離心→沉淀復(fù)溶→除蛋白質(zhì)→醇沉→離心、洗滌沉淀→真空冷凍干燥→粗多糖。

將新鮮川明參清洗除去泥土等雜質(zhì)，置于鼓風(fēng)干燥箱中，60℃，干燥，至恒重，粉碎，過80目篩，石油醚：95%乙醇（V∶V）1∶1回流脫脂、脫色和除去小分子糖[11]，濾渣60℃干燥，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 川明參多糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定[12]。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取105℃烘干至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖對(duì)照品0.1g（精確到0.0001g），加蒸餾水溶解并定容于100mL容量瓶中，得到1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取2、4、6、8、10mL于100mL容量瓶中定容得到20、40、60、80、100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL，置于具塞試管中，各加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0mL，搖勻后室溫放置5min，置沸水浴中加熱15min，迅速冷卻至室溫，另以蒸餾水2mL加苯酚和濃硫酸，同上操作為空白對(duì)照[13]。采用掃描型紫外可見分光光度計(jì)在300～800nm范圍內(nèi)掃描，在最大吸收波長處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制吸光度-葡萄糖質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 采用水提醇沉法制備粗多糖，醇沉方法參考張梅等[14]，并有所改動(dòng)。稱取適量預(yù)處理后的川明參粉，用蒸餾水按一定的料液比（川明參粉∶蒸餾水，g/mL）、超聲提取溫度、超聲功率、超聲作用時(shí)間及提取次數(shù)超聲提取，趁熱減壓抽濾，濾液濃縮至10～15mL，加無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%沉淀多糖，靜置過夜，離心，沉淀部分用蒸餾水溶解，稀釋一定倍數(shù)得川明參多糖待測(cè)液。

1.2.2.3 川明參多糖含量的測(cè)定 準(zhǔn)確移取2mL一定稀釋倍數(shù)的川明參多糖待測(cè)液，按照1.2.2.1的操作方法加入苯酚和濃硫酸，以蒸餾水代替樣品作為空白，于489nm處測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定三次，計(jì)算川明參多糖提取率。間15min，超聲次數(shù)2次，采用以上選出的結(jié)果，考察超聲溫度30、40、50、60、70、80℃對(duì)川明參多糖提取率的影響。

1.2.3.3 超聲功率 固定超聲作用時(shí)間15min，超聲次數(shù)2次，采用以上選出的結(jié)果，考察超聲功率80、100、120、140、160、180W對(duì)川明參多糖提取率的影響。

1.2.3.4 超聲時(shí)間 固定超聲次數(shù)2次，其他條件采用以上選出的結(jié)果，考察提取時(shí)間15、30、45、60min對(duì)川明參多糖提取率的影響。

1.2.3.5 超聲次數(shù) 采用以上選出的結(jié)果為固定條件，提取4次，測(cè)定每一次川明參多糖的提取率。

1.2.4 川明參多糖超聲提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平，按L9（34）正交設(shè)計(jì)[15]進(jìn)行川明參多糖超聲提取正交實(shí)驗(yàn)，各因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the L9（34）orthogonal design

1.2.5 超聲提取法與常規(guī)提取法的比較 分別對(duì)超聲提取法、常溫浸漬法、熱浸提法進(jìn)行川明參多糖的提取率的測(cè)定，比較三者的優(yōu)劣。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.2.2.1方法，經(jīng)掃描后得到波長489nm為最大吸收波長，即489nm為測(cè)定波長。以葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制吸光度-葡萄糖質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0133x+0.0127，r=0.9992。結(jié)果表明，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度在20～100μg/mL范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

圖1 料液比對(duì)川明參多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)川明參多糖提取率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在料液比1∶10～1∶40時(shí)，川明參多糖提取率增加，并由增長緩慢到逐漸加快，這是因?yàn)樵趥髻|(zhì)過程中，隨著提取劑的增加，溶液中多糖濃度逐漸稀釋，增加了固相與液相間多糖的濃度差，加快了傳遞速度，當(dāng)料液比達(dá)到1∶40時(shí)，提取率達(dá)到最大，但料液比1∶50時(shí)提取率明顯下降，可能是因?yàn)榱弦罕冗^大，增加了超聲波破碎細(xì)胞的阻力，使細(xì)胞破碎程度下降，從而降低了多糖的提取率[16]，也有可能是其他雜質(zhì)溶出抑制了多糖的溶出。此外，隨著蒸餾水量的增加，提取液濃縮的難度加大，濃縮時(shí)間過長也會(huì)影響多糖的提取率。因此，綜合各因素，選擇最佳料液比為1∶40。

2.2.2 超聲溫度對(duì)川明參多糖提取率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，超聲溫度低于70℃時(shí)，提取溫度越高，川明參多糖的提取率越高，這是因?yàn)榈蜏貢r(shí)，超聲波未能使細(xì)胞徹底破碎，而隨著溫度的增加，分子的熱運(yùn)動(dòng)加速，進(jìn)一步破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使多糖充分釋放；溫度高于70℃后，多糖的提取率下降，這是因?yàn)楦邷睾统暡ㄆ扑榈膮f(xié)同作用導(dǎo)致部分川明參多糖破壞和降解，影響了川明參多糖的提取率[17-18]。因此，川明參多糖的超聲提取溫度不宜超過70℃。

圖2 超聲溫度對(duì)川明參多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

2.2.3 超聲功率對(duì)川明參多糖提取率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，在超聲功率80～140W時(shí)，隨著功率的增大，川明參多糖的提取率逐漸增加，超聲波功率為140W時(shí)，提取率達(dá)到最大值，當(dāng)功率超過140W時(shí)，多糖提取率逐漸降低。這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間固定，超聲波的破碎作用主要取決于超聲波的功率，功率越大，超聲波對(duì)細(xì)胞的破碎作用越強(qiáng)，但當(dāng)超聲功率大于一定程度時(shí)，提取液的流動(dòng)加速，減少了物料在超聲場(chǎng)中的停留時(shí)間，細(xì)胞破碎作用也就隨之減弱[16]。另外，高功率作用可能會(huì)導(dǎo)致多糖分子糖苷鍵的斷裂，從而影響多糖提取率。因此超聲功率以140W為宜。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)川明參多糖提取率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在10～45min時(shí)，多糖的提取率隨著超聲時(shí)間的增加而明顯提高，45min時(shí)川明參多糖提取率最高，隨著時(shí)間的繼續(xù)延長，多糖提取率呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，川明參細(xì)胞破碎度逐漸增大，多糖溶出量逐漸增加，提取率提高；時(shí)間過長，細(xì)胞進(jìn)一步破碎，雜質(zhì)的溶出相應(yīng)增多，川明參多糖的提取率隨之降低，而且超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長時(shí)間作用會(huì)使大分子的多糖斷裂，影響多糖的提取率[18]。因此超聲波作用時(shí)間以45min為宜。

圖3 超聲功率對(duì)川明參多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

圖4 超聲作用時(shí)間對(duì)川明參多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

2.2.5 超聲次數(shù)對(duì)川明參多糖提取率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，超聲提取兩次已達(dá)到基本提取完全，所以從經(jīng)濟(jì)合理性考慮，選取超聲提取2次為最佳提取次數(shù)。

圖5 超聲次數(shù)對(duì)川明參多糖提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic action times on the extraction yield of polysaccharides from chuanminshen violaceum

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲溫度（A），超聲功率（B），料液比（C），超聲時(shí)間（D）4個(gè)因素作為考察指標(biāo)。采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，提取次數(shù)固定為2次，進(jìn)行優(yōu)化川明參多糖的提取工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 2 Trials and results of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

由表2中R值可知，影響川明參多糖提取率的先后順序是：料液比＞超聲提取溫度＞超聲功率＞超聲作用時(shí)間。由表3方差分析結(jié)果可知，超聲提取溫度、超聲功率、料液比對(duì)提取率的影響極為顯著，超聲作用時(shí)間對(duì)提取率的影響不顯著。由k值大小可知，優(yōu)化工藝組合為A2B2C2D2，此結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳條件組合一致，而正交實(shí)驗(yàn)提取率最高組合為A2B3C1D2，又因超聲功率和料液比對(duì)提取率的影響極為顯著，故將兩組合分別進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 4 Results of verification experiment（n=3）

由表4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，川明參多糖超聲提取的最佳工藝組合為A2B2C2D2，即超聲溫度70℃，超聲功率140W，料液比1∶40，超聲作用時(shí)間45min，提取2次，得到川明參多糖提取率為最高值47.13%，RSD為0.11%。

2.4 超聲提取法與常規(guī)提取法的比較

準(zhǔn)確稱取一定量預(yù)處理后的川明參粉，固定提取溫度70℃（常溫浸漬法除外），料液比1∶40，提取次數(shù)2次，相對(duì)延長熱浸提和常溫浸漬法的提取時(shí)間，測(cè)定三種提取方法川明參多糖的提取率，實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果見表5。

表5 超聲提取與常規(guī)提取法的比較Table 5 Comparison of three extraction methods

由表5可知，超聲提取法較常規(guī)提取法有較大優(yōu)勢(shì)，不僅明顯提高了多糖的提取率，而且大大縮短了提取時(shí)間，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，采用超聲法提取了川明參多糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響超聲提取川明參多糖提取率的四個(gè)因素中超聲提取溫度、超聲功率、料液比對(duì)提取率的影響極為顯著，超聲作用時(shí)間對(duì)提取率的影響不顯著，其先后順序?yàn)椋毫弦罕龋境曁崛囟龋境暪β剩境曌饔脮r(shí)間。綜合考慮各因素得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為：超聲溫度70℃，超聲功率140W，料液比1∶40，超聲作用時(shí)間45min，提取2次。在該條件下川明參多糖的提取率是47.13%。與常規(guī)水提法相比，超聲法安全、簡(jiǎn)單易行、效率高，是一種提取川明參多糖的有效途徑。

[1]佘盂蘭，單人驊.傘形科兩新屬——環(huán)根芹屬和川明參屬[J].植物分類學(xué)報(bào)，1980，18（1）：45-49.

[2]萬德光，彭成，趙軍寧.四川道地中藥材志[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2005：53.

[3]李幫經(jīng)，周燕，王明安，等.滋補(bǔ)藥材川明參的化學(xué)成分分析[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2003，22（11）：59-60.

[4]李宏，邵承斌.川明參多糖的遺傳毒理學(xué)檢驗(yàn)——對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核的影響[J].渝州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1996，13（4）：29-32.

[5]陳丹丹，彭成.川明參的藥理作用及開發(fā)前景[J].中藥與臨床，2011，2（2）：35-37.

[6]陳丹丹，彭成.川產(chǎn)道地藥材川明參抗疲勞和抗氧化作用研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2011，25（1）：28-30.

[7]Song X，Yin ZQ，Li Li，et al.Antiviral activity of sulfated Chuanminshen violaceum polysaccharide against duck enteritis virus in vitro[J].Antiviral Research，2013，98：344-351.

[8]張梅，雨田，蘇筱琳，等.川明參多糖理化性質(zhì)和免疫活性研究[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22（4）：396-398.

[9]雷曉莉，張梅.不同加工方法對(duì)川明參多糖及歐前胡素含量的影響[J].中藥與臨床，2012，3（2）：34-38.

[10]呂明生，王淑軍，房耀維，等.超聲波提取雪蓮薯多糖工藝優(yōu)化及其對(duì)羥自由基的清除[J].食品科學(xué)，2011，32（2）：24-27.

[11]杜清，秦民堅(jiān)，郭巧生.明黨參多糖提取工藝研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19（4）：51-53.

[12]雷曉莉，宋芳芳，彭成，等.不同產(chǎn)地川明參藥材中多糖含量測(cè)定[J].中藥與臨床，2011，2（1）：49-54.

[13]鐘振聲，孫立杰，馮焱，等.超聲波法提取人參多糖的研究[J].化學(xué)與生物工程，2006，26（6）：30-32.

[14]張梅，雨田，蘇筱琳，等.川明參多糖的提取工藝[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22（3）：361-362.

[15]杜榮騫.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2003：119-139.

[16]范三紅，原超，劉艷榮，等.超聲波輔助提取南瓜籽油及其脂肪酸組成研究[J].食品科學(xué)，2010，31（24）：107-110.

[17]孟憲軍，李冬男，汪艷群，等.五味子多糖超聲波提取條件的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（4）：313-315.

[18]李桂娟，李沖，姜雪，等.松籽殼多糖超聲輔助溶劑法提取及抗氧化性研究[J].食品與機(jī)械，2012，28（6）：133-137.

Optimizing ultrasonic extraction of plysaccharides from Chuanminshen violaceum based on orthogonal experiments design

DONG Hong-min1，LI Su-qing1，NIU Xiao-yong2，SHEN Li-wen1，LI Lu1，QIN Wen1，*
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Langzhong Supply and Marketing Cooperative，Langzhong 637400，China）

In order to obtain optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from Chuanminshen violaceum，the effect of the solid-liquid ratio，extraction temperature，ultrasonic power，ultrasonic action time and the extraction times of the polysaccharides by single factor experiments and orthogonal experiments in distilled water were investigated.The content of polysaccharides was determined by phenol-vitriol colorimetry method. The decreasing order of importance of the four process conditions affecting polysaccharide extraction was solid-liquid ratio，extraction temperature，ultrasonic power and ultrasonic action time.The orthogonal experimental results showed that the optimal conditions were extraction temperature 70℃，ultrasonic power 140W，solidliquid ratio 1∶40，ultrasonic action time 45min，2 times.Under this condition，the average rate of extraction of polysaccharides was 47.13%.

Chuanminshen violaceum，ultrasonic extraction，polysaccharides，orthogonal experiments design

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0306-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.061

2013－08－28 *通訊聯(lián)系人

董紅敏（1989-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理與品質(zhì)控制。