鄒金美，羅開梅，方清靈，葉玉華，余香妹，張國廣

（閩南師范大學生物科學與技術學院，福建漳州363000）

響應面法優(yōu)化超聲波法提取楮頭紅中總黃酮的工藝研究

鄒金美，羅開梅，方清靈，葉玉華，余香妹，張國廣*

（閩南師范大學生物科學與技術學院，福建漳州363000）

采用響應面法優(yōu)化楮頭紅鮮草中總黃酮的超聲波提取工藝。在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法優(yōu)化超聲提取工藝條件。結果表明，楮頭紅總黃酮的最佳超聲提取工藝為：提取溫度56℃、超聲功率870W、超聲時間51min，該工藝條件下楮頭紅中總黃酮提取率為2.53mg/g，與預測值（2.55mg/g）的相對誤差為0.87%，研究結果可以為楮頭紅總黃酮的提取提供參考。

楮頭紅，總黃酮，提取率，響應面分析

楮頭紅（Sarcopyramis nepalensis Wall）是野牡丹科肉穗草屬植物，又名風柜斗草、耳環(huán)草，在我國主要分布于廣東、廣西、臺灣、福建、江西、云南、湖北、湖南等省份，全草可藥用，具有清熱平肝、利濕解毒之功效，主治肺熱咳嗽、頭目眩暈、耳鳴、耳聾、目赤羞明、風濕痹病、跌打傷腫、疔瘡腫毒[1]，該植物鮮草或干草在福建等地使用廣泛，尤其對急性肝炎（甲肝、乙肝急性期）療效最佳，對慢性肝炎及肝炎病毒攜帶者也有療效[2-3]，在福建漳州除中藥房外，市場上常年有鮮草售賣，是一種具有很好開發(fā)價值的藥用植物資源。超聲波提取法是利用超聲波產(chǎn)生的機械作用、擴散、熱效應以及空化作用加速細胞壁的破碎，促進細胞內(nèi)有效成分的擴散和溶出[4]。具有提取時間短，有效成分提取率高，成本低、低溫保護熱敏性成分、污染小等優(yōu)點，近年來被廣泛用于黃酮類物質的提取[5-8]。楮頭紅中富含黃酮類、多糖、多酚、皂苷、鞣質、還原糖、有機酸、萜類等化學成分[2-3，9-16]，僅有其多糖物質提取工藝的報道[9]，主要活性成分物質總黃酮的提取工藝研究尚未見報道。本研究以楮頭紅鮮草為實驗材料，采用超聲波提取法，在單因素實驗的基礎上進行響應面優(yōu)化，從而確定超聲波提取楮頭紅總黃酮的最佳工藝，為楮頭紅的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

楮頭紅鮮草 漳州市薌城區(qū)北橋市場青草鋪；蘆丁標準品 中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇、氫氧化鈉、九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉 國藥集團化學試劑公司。

FJ200高速分散均質機 上海標本模型廠；AR124CN電子分析天平 美國奧豪斯公司；JY99-2D超聲波細胞破碎儀 寧波新芝公司；UV-1750紫外可見光分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮標準曲線的繪制 蘆丁配制成濃度為0.1mg/mL標準液，采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法測定標準曲線[16]。標準品蘆丁取樣量分別為0、1、2、3、4、5mL的6支反應管中測得的吸光值分別為0、0.138、0.264、0.395、0.518、0.644，經(jīng)計算線性回歸方程為A= 1.2831x+0.0057，R2=0.9997，蘆丁標準品在一定濃度范圍內(nèi)與吸光度值呈良好線性關系。

1.2.2 楮頭紅中總黃酮的超聲波提取單因素實驗

將新鮮楮頭紅植株洗凈，晾干后稱取4g，研缽研碎，加40mL 60%乙醇于均質機上高速勻漿10min，再加入40mL 60%乙醇將勻漿的樣品沖洗入燒杯中（液料比為1∶20），將燒杯置于超聲波細胞破碎儀中超聲破碎提取。分別考察四個單因素乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、無水乙醇）、超聲功率（400、600、800、1000、1200W）、超聲時間（20、30、40、50、60min）、提取溫度（35、45、55、65、75℃）對楮頭紅中總黃酮提取率的影響。當考察上述某個單因素時，該因素為變量，其他因素固定設置為提取時間50min，超聲功率800W、提取溫度55℃，破碎程序是破碎15s、間歇15s、超聲頻率40Hz，超聲提取結束后抽濾得澄清溶液即為粗黃酮提取液。

1.2.3 楮頭紅中總黃酮提取率的計算 量取1mL總黃酮提取液，按NaNO2-Al（NO3）3顯色步驟顯色后[16]，在300～800nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，光譜數(shù)據(jù)顯示可見光區(qū)樣品最大吸收峰與蘆丁最大吸收峰510nm基本吻合，將樣品510nm處吸光值數(shù)據(jù)代入線性回歸方程求得濾液中總黃酮濃度，按公式Y（mg/g）=C×V/M計算楮頭紅總黃酮提取率。式中：C為提取液中總黃酮濃度（mg/L）；V為抽濾后的濾液總體積（L）；M為稱取的楮頭紅鮮品質量（g）。

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，以楮頭紅總黃酮提取率為響應值，根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理，運用Design Expert 8.0軟件設計三因素三水平響應面實驗，考察提取溫度、超聲功率、超聲時間及因素間交互作用對楮頭紅總黃酮提取率的影響（表1）。

表1 響應面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結果與分析

2.1 光譜掃描結果

蘆丁標準品和楮頭紅樣品亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色后光譜掃描結果（見圖1）表明可見光區(qū)蘆丁在510nm處、楮頭紅樣品在509nm處有最大吸收峰，二者吻合度很高，本研究楮頭紅總黃酮定量方案合理。

2.2 單因素實驗結果

圖1 樣品和蘆丁NaNO2-Al（NO3）3顯色后紫外可見光光譜圖Fig.1 Spectral scanning picture of rutin and sample solution with NaNO2-Al（NO3）3

2.2.1 不同乙醇濃度對楮頭紅總黃酮提取率的影響

結果表明（見圖2），乙醇濃度對楮頭紅總黃酮提取率有較大影響，濃度低于60%時總黃酮提取率較低，60%～80%濃度范圍內(nèi)總黃酮提取率最高，濃度繼續(xù)升高提取率下降，可能楮頭紅總黃酮成分多樣，部分是水溶性的，部分是醇溶性的，合適體積分數(shù)的乙醇溶液才能達到同時溶解水溶性和醇溶性黃酮的目的[17]，考慮到黃酮提取率和提取溶劑成本選取60%體積分數(shù)的乙醇作為提取溶劑。

圖2 乙醇濃度對楮頭紅總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of S.nepalensis Wall total flavonoids

圖3 提取溫度對楮頭紅總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extract temperature on extraction yield of S.nepalensis Wall total flavonoids

2.2.2 提取溫度對楮頭紅總黃酮提取率的影響 結果表明（見圖3），當溫度小于55℃時，隨著溫度的增高，楮頭紅總黃酮提取率也隨之增加，65℃時總黃酮提取率略有下降，提取溫度超過65℃時，總黃酮提取率下降比較明顯，可能是合適的高溫可以增強超聲波對細胞的破壞作用，加快總黃酮的滲透和擴散速度，但溫度過高時，會造成黃酮物質發(fā)生降解[5]；另外溫度越高浸提溶劑乙醇揮發(fā)越快，會影響黃酮的浸出[18]，因此確定提取溫度在55℃左右較合適。

2.2.3 超聲功率對楮頭紅總黃酮提取率的影響 結果表明（見圖4），當超聲功率小于800W時，總黃酮提取率隨著超聲功率的增加而提高，當超聲功率達到800W時，總黃酮提取率達到最大值，功率繼續(xù)增大時，提取率反而下降，可能是超聲功率過大會對黃酮類物質造成破壞[7]，考慮到能耗和成本因素選取800W為最佳超聲功率。

圖4 超聲功率對楮頭紅總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction yield of S.nepalensis Wall total flavonoids

2.2.4 超聲時間對楮頭紅總黃酮提取率的影響 結果表明（見圖5），當超聲提取時間小于40min時，總黃酮提取率隨著超聲時間的增加而提高，當超聲時間達到50min時，總黃酮提取率達到最大值，時間繼續(xù)延長時，提取率會緩慢下降，可能是超聲波處理時間過久會對某些黃酮類物質造成破壞所致[7]。

圖5 超聲處理時間對楮頭紅總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on extraction yield of S.nepalensis Wall total flavonoids

2.3 響應面優(yōu)化總黃酮提取工藝的結果

2.3.1 回歸模型的建立與分析 在單因素實驗的基礎上，選取提取溫度、超聲功率和超聲時間進行三因素三水平中心組合實驗，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，利用響應面分析方法優(yōu)化楮頭紅黃酮提取工藝參數(shù)，設計17次實驗，其中析因實驗12次，中心組合實驗重復5次，實驗設計方案及結果如表2所示，方差分析見表3。

表2 響應面設計方案及實驗結果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 回歸方差分析表Table 3 Variance analysis of mathematical regression model

利用Design Expert 8.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到響應回歸方程：Y=+2.50+ 0.10A+0.23B+0.098C-0.043AB-0.058AC-0.11BC-0.36A2-0.31B2-0.35C2。

由表3的方差分析可知，該模型極顯著，預測值與實驗值有高度的相關性（R2=0.9720）；失擬項不顯著（p=0.576＞0.05），說明殘差均由隨機誤差引起；表明此模型對于楮頭紅中總黃酮提取率實際值與預測值之間具有很好的擬合度，可用該模型對楮頭紅的總黃酮提取率進行很好地分析、預測和確定總黃酮的最佳提取工藝。由表3還可看出，所選3個因素對總黃酮提取率有顯著影響，由p值可以看出，各因素對總黃酮提取率影響的順序為：B（超聲功率）＞A（提取溫度）＞C（提取時間）。

2.2.2 楮頭紅總黃酮提取工藝響應面分析與優(yōu)化

響應曲面反映了當提取溫度、超聲功率、超聲時間三個因素的任意一個變量取零點水平的時候，其他兩個因素的交互作用對楮頭紅總黃酮提取率的影響情況（圖6～圖8）。曲面陡表明該因素對提取率的影響顯著，曲面平緩表明該因素對提取率的影響不顯著；等高線的形狀反映兩因素交互作用的強弱，橢圓形表明交互作用強，影響顯著，圓形則相反；等高線密集表明對提取率影響較大，稀疏表明影響較小[6，8]。從三幅圖中可以看出超聲功率相較于提取溫度、超聲時間的曲線陡峭，說明功率對總黃酮的影響最大；三組三維圖的投影即等高線較圓，說明兩因素交互作用對提取率影響不顯著，均與回歸方差分析結果一致。

圖6 超聲時間和提取溫度交互作用的響應面圖Fig.6 Response surface plot of ultrasonic time and extract temperature

圖8 超聲功率和提取溫度的響應面圖Fig.8 Response surface plot of ultrasonic power and extration temperature

2.2.3 最佳工藝的預測與驗證 利用Design-expert 8.0的optimization功能，將總黃酮提取率的目標選項設定為maximize，可得到一個最優(yōu)的方案，即：提取溫度為56.11℃、超聲功率為868.9W、超聲時間50.77min，楮頭紅中總黃酮提取率預測值為2.552mg/g。在實際操作中選擇提取工藝參數(shù)為：提取溫度56℃、超聲功率870W、超聲時間51min，進行了五次驗證實驗所得的總黃酮平均提取率為2.53mg/g，與預測值之間的相對誤差僅為0.87%，表明用響應面法對楮頭紅中總黃酮超聲提取的各因素進行優(yōu)化研究是可行的。

3 結論

采用超聲波法提取楮頭紅鮮草中的總黃酮，通過單因素實驗和響應曲面分析優(yōu)化工藝條件，并結合實際操作確定楮頭紅中總黃酮超聲提取的最佳工藝為：提取溫度56℃、超聲功率870W、超聲時間51min，提取率為2.53mg/g，提取率較高，可為楮頭紅總黃酮的提取提供參考依據(jù)。

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Optimization of ultrasonic extraction of total flavonoids from Sarcopyramis nepalensis Wall using response surface methodology

ZOU Jin-mei，LUO Kai-mei，F(xiàn)ANG Qing-ling，YE Yu-hua，YU Xiang-mei，ZHANG Guo-guang*
（School of Biological Science and Technology，Minnan Normal University，Zhangzhou 363000，China）

To optimize extraction yield of total flavonoids from Sarcopyramis nepalensis Wall using ultrasonic extraction method，the study was designed and carried using response surface methodology.On the basis of single-factor experiments，extraction conditions of the extraction yield of total flavonoids from S.nepalensis Wall were optimized by response surface analysis method.Results showed that the optimum extraction conditions were as following：extraction temperature 56℃，ultrasonic power 870W，ultrasonic time 51min.The confirmatory test value of extraction yield of total flavonoids was 2.53mg/g，the relative standard deviation was 0.87%with predicted value（2.55mg/g）.Results could provide a reference for the total flavonoids extraction from S.nepalensis Wall.

S.nepalensis Wall；total flavonoids；extraction yield；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0245-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.047

2013－08－16 *通訊聯(lián)系人

鄒金美（1973-），女，碩士研究生，副教授，主要從事植物學及其次生代謝產(chǎn)物方面的研究。

福建省自然科學基金指導性科技計劃項目（2012D138）；福建省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目；校創(chuàng)新團隊項目。