張 棟，張曉瑜，湯 輝，張秀敏，張利平

（河北大學生命科學學院，河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北保定071002）

河北平泉農(nóng)田土壤放線菌物種多樣性篩查

張 棟，張曉瑜，湯 輝，張秀敏，張利平*

（河北大學生命科學學院，河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北保定071002）

針對河北平泉縣典型的農(nóng)田土壤類型，采用基于全長16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析的免培養(yǎng)技術，并結合放線菌門特異引物的篩查，揭示了土壤中放線菌的物種多樣性。構建的放線菌16S rRNA克隆文庫中的596個放線菌序列歸屬于29個屬，17個科，12個亞目和2個亞綱，并確定了其優(yōu)勢菌屬，其中芽球菌屬（Blastococcus）（占放線菌總克隆數(shù)的12.75%），類諾卡氏菌屬（Nocardioides）（9.39%），節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）（8.72%），小月菌屬（Microlunatus）（5.37%），酸土單胞菌屬Aciditerrimonas（4.69%），沉積巖桿菌屬Ilumatobacter（3.35%）。本文為深入理解放線菌的生態(tài)功能，及更深層次的放線菌資源的研究、開發(fā)和利用提供寶貴的科學資料和豐富的物種信息資源。

16S rRNA，放線菌，克隆文庫

平泉縣位于河北省東北部，為遼寧、內(nèi)蒙、河北三省交界地，東與遼寧省的凌源市接壤，北與內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市寧城縣相連，西鄰承德縣，南鄰寬城縣。全縣農(nóng)田水利基本建設深入開展，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件便利，2012年全縣水澆地面積達到21.4萬畝，建成噸糧田10萬畝，千元田10.8萬畝。曾被列為全國商品糧、玉米制種生產(chǎn)基地縣，農(nóng)田是這一區(qū)域的代表性土壤。對平泉縣土壤放線菌多樣性進行調(diào)查，揭示其中的放線菌分布狀態(tài)，將為更深層次的放線菌資源的研究、開發(fā)和利用，提供寶貴的科學資料和豐富的物種信息資源。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，產(chǎn)生了多種免培養(yǎng)技術來探測環(huán)境中微生物的多樣性，并應用于微生物資源的開發(fā)利用。免培養(yǎng)技術能夠快速全面的調(diào)查環(huán)境樣品中微生物的多樣性，尤其是能獲得難于分離培養(yǎng)的微生物種類信息?？梢园凑张c免培養(yǎng)放線菌菌株系統(tǒng)發(fā)育關系相近的可培養(yǎng)放線菌的新陳代謝特性及營養(yǎng)需求設計培養(yǎng)條件，為分離未知放線菌提供了新的途徑。而在選擇性分離前研究放線菌的分布與多樣性對獲得放線菌資源非常重要[1-3]，這既可避免盲目采樣，又可提高選擇性分離的效率。特異性PCR技術結合文庫分析技術，可以提供最豐富、詳細的群落、基因等勘探，可以更準確、有效的研究目的微生物類群的多樣性[4-5]。因此，本研究將特異性PCR與文庫分析技術相結合共同分析平泉縣農(nóng)田土壤中放線菌多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣本 自平泉縣的平泉鎮(zhèn)、榆樹林子鎮(zhèn)、楊樹嶺鎮(zhèn)、七溝鎮(zhèn)、小寺溝鎮(zhèn)、黨壩鎮(zhèn)選取農(nóng)田土壤進行5點取樣，取距地表5～20cm的土壤，去除植物殘體、沙石，混合后過篩（孔徑1mm），放入無菌的塑料自封袋中，作為一個土壤樣本，共獲得6個土壤樣本，立即置于干冰上，運回實驗室-80℃保存；DNA提取液

100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L Na2EDTA，200mmol/L氯化鈉，3%CTAB（W/V）；TENP緩沖液 50mol/L Tris，100mol/L Na2EDTA，100mmol/L NaCl，0.01g/mL PVP，pH10；PBS緩沖液 135mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，1.5mmol/L KH2PO4，8mmol/L K2HPO4，pH7.2；LB固體培養(yǎng)基 蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，瓊脂粉2g，去離子水1L，pH7.0；LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，去離子水1L，pH7.0；Taq DNA聚合酶 Takara公司；異丙醇，乙醇，液氮，Tris平衡酚，氯仿，異丙醇，醋酸鈉等。

BHC-1300ⅡA/B3型超凈工作臺 蘇靜集團安泰公司；CT6E型臺式離心機 日本日立；HY-5A型回旋式振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京市醫(yī)療設備總廠；DRP-9162型恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；溫度梯度PCR儀 德國Whatman Biomentra公司；DYY-Ⅲ-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；Gel DocTMXR+紫外凝膠成像系統(tǒng) 美國SIM Internation Group Co.LTD；PowerSoilTMDNA提取試劑盒 MO BIO Laboratories公司；Inhibitor Removal Resin樹脂柱Epicentre Biotechnologies公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 北京康為世紀生物科技有限公司；16S rDNA測序分析 北京寶銳通生物科技有限公司。

1.2 土壤宏基因組DNA的提取、純化

每個土壤樣本稱取1g，按PowerSoilTMDNA提取試劑盒操作手冊進行DNA的提取，DNA粗提物通過Inhibitor Removal Resin樹脂柱進行純化?？侱NA溶于20μL無菌水，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。每個土樣提取3次DNA后混合作為該土樣宏基因組DNA。

1.3 細菌16S rDNA克隆文庫的構建

以每個土樣的宏基因組DNA為模板，27F（5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1525R（5’-AGAA AGGAGGTGATCCAGCC-3’）為引物對[6]，Taq DNA聚合酶擴增16S rDNA。反應條件為：94℃預變性5min；96℃10s，60℃10s，72℃1min，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。每個土樣挑取2000個克隆子，合并構建平泉土壤細菌16S rRNA克隆文庫?？寺∥膸熘锌寺∽臃植记闆r見表1。

1.4 土壤放線菌的篩查

對總共12000個克隆子的克隆文庫進行放線菌門特異引物的篩選。以引物對Com2xf（5′-AAACTCA AAGGAATTGACGG-3′）和Ac1186（5′-CTTCCTCCGA GTTGACCC-3′）[7]進行第一輪PCR擴增篩查，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑出陽性放線菌克隆子，其余克隆子再以引物對SC-Act235-aS-20（5′-CCGTACT CCCCAGGCGGGG-3′）和SC-Act878-aA-19（5′-CGC GGCCTATCAGCTTGTTG-3′）進行第二輪PCR擴增篩查，經(jīng)電泳檢測，再次挑出陽性克隆子。合并兩次篩查的放線菌克隆子構建平泉農(nóng)田土壤放線菌16S rRNA克隆文庫，克隆子進行16S rDNA測序分析，應用Sequencher軟件對DNA序列進行拼接和編輯。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序獲得的序列用MEGA 5.0軟件進行多重序列比對。以97.0%相似性為標準劃分不同的操作分類單元（Operational taxonomic unit，OUT）[8]。使用軟件EstimateS 8.2通過Estimated sample coverage、Shannon Index、Simpson Index、Species richness等相關指數(shù)進行樣點克隆文庫的放線菌多樣性評價分析。利用MOTHUR v.1.19.4對測序獲得596個克隆的16S rDNA序列進行OUTs（cutoff=0.03）的劃分，并選出每個OUT的代表序列同GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對。

測序得到的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫（www.ncbi. nlm.nih.gov），序列接收號分別為KC554071-KC555031。利用DNAMAN軟件對測序結果進行同源性比較，利用BLAST軟件（www.ncbi.nlm.nih.gov），將測定得到的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列比對分析，獲取相近典型菌株的基因序列。利用Clustal W和Mega中的鄰接法（Neighbor-Joining）建立系統(tǒng)發(fā)育樹[9]，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。其中的遺傳距離用Tamura-Nei公式計算，枝長代表了分歧程度。

2 結果與分析

2.1 放線菌克隆子的檢出

Com2xf/Ac1186引物對擴增產(chǎn)物大小約270bp，SC-Act235-aS-20/SC-Act878-aA-19引物對擴增產(chǎn)物大小約640bp（圖1）。自16S rDNA克隆文庫中經(jīng)兩輪擴增篩查，共得到596個陽性放線菌克隆子，其中第一對引物檢出476個，第二對引物檢出120個，總檢出率為4.5%。

16S rDNA序列輸入RDP（Ribosomal Database Project）數(shù)據(jù)庫中進行初步分群，結果表明篩查出的596個放線菌陽性克隆子均為放線菌門，表明本研究采用的放線菌門引物特異性檢出效果準確可靠。當只用第一對引物檢測時，有陽性放線菌克隆子遺漏，第一對和第二對兩對放線菌門特異性引物結合使用時，其檢出放線菌更加豐富。

圖1 以放線菌特異引物篩查細菌16S rRNA克隆文庫Fig.1 Agarose gel electrophoresis of screening bacterial 16S rRNA clone library with actinobacterial specific primers

2.2 放線菌的物種多樣性

對克隆的測序結果應用RDPⅡ中的ChimeraCheck程序檢查所獲得的序列，結果無嵌合體發(fā)現(xiàn)。統(tǒng)計學分析表明樣本文庫的覆蓋率估計（C）值為94.9%，稀釋曲線亦基本趨向平臺期，基本上可涵蓋環(huán)境中的大多數(shù)放線菌的種類。平泉農(nóng)田土壤放線菌16S rDNA克隆文庫的物種豐度（Species richness）為21.8，反映了該環(huán)境樣品中放線菌具有較高的多樣性情況；香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）為4.459，說明樣品中微生物的多樣性十分豐富；辛普森指數(shù)（Simpson index）為0.9833，說明該環(huán)境樣品中均勻性很好。構建的放線菌16S rDNA克隆文庫含有豐富的放線菌多樣性，包含了該樣點絕大多數(shù)放線菌的數(shù)量，能夠代表該樣點放線菌的實際情況。

將107個OUTs的序列與比對結果中相近的已知放線菌類群的有效序列，共同構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以Escherichia coli DSM30083T（X80725）的16S rDNA序列作為外群。

表1 放線菌克隆子的分布Table 1 Distribution of actionbacterial clones in libraiy

由表1和圖2，文庫中596個放線菌序列歸屬于29個屬，17個科，12個亞目，2個亞綱。絕大部分序列歸屬于放線菌亞綱（Actinobacteridae）已知的9個亞目，占放線菌總克隆數(shù)的77.85%。此外，酸微菌亞綱（Acidimicrobidae）占了16.11%，另有4%的克隆歸屬于紅色桿菌亞綱（Rubrobacteridae），而沒有發(fā)現(xiàn)與紅蝽菌亞綱（Coriobacteridae）中親緣關系較近的序列，與有效發(fā)表的所有已知類群無較近的親緣關系、未確定分類地位的序列占27.3%。數(shù)量較多的克隆子有芽球菌屬（Blastococcus）（占放線菌總克隆數(shù)的12.75%），類諾卡氏菌屬（Nocardioides）（9.39%），節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）（8.72%），小月菌屬（Microlunatus）（5.37%），酸土單胞菌屬（Aciditerrimonas）（4.69%），沉積巖桿菌屬（Ilumatobacter）（3.35%）。

圖2 平泉土壤樣品放線菌克隆文庫16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbour-Joining tree showing the phylogenetic relationships among acinobacterial 16S rDNA sequences obtained from Pingquan soil samples

3 討論

平泉縣受到來自于南部京津地區(qū)日益增強的人類干擾壓力和北部內(nèi)蒙古干旱區(qū)荒漠化加劇的雙重影響，放線菌的分布存在較明顯的富集現(xiàn)象，在克隆子數(shù)量較多的菌屬中芽球菌屬為弗蘭克氏菌目中的放線菌[10]，現(xiàn)有3個已知種，雖然自海洋[11]、土壤、植物[12]樣本中均有分離得到，但其典型的存在環(huán)境是在石頭樣本中[13]，也在沙漠地區(qū)的沙塵和敷雪在阿爾卑斯山[14]或喜馬拉雅山[15]等貧瘠的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)。類諾卡氏屬不僅分布廣、種類多，而且其中很多菌株具有許多生態(tài)功能：如降解二苯駢呋喃[16]、原油[17]、p-硝基酚[18]、吡啶[19]等，還有報道表明類諾卡氏屬菌株廣泛分布在種植農(nóng)作物的土壤中，具有三嗪水解酶，能分解代謝一系列甲硫代三嗪除草劑[20]，某些菌株可以利用C2－C16的一系列烷烴以及苯酚等做碳源[21-22]。節(jié)桿菌屬中近年來被報道也有很多都具有降解有機物的功能如：降解甲基對硫磷[23]、草甘膦[24]、菊酯類殺蟲劑[25]、石油[26]等，在農(nóng)田中廣泛使用的有機肥、農(nóng)藥等都使得這一類群得到富集。

平泉縣位于燕山山脈末端是對人類活動和全球氣候變化較為敏感的地區(qū)。這種人為活動造成某些種類放線菌大量富集的同時，可能會導致土壤中原有的有潛在應用價值的特有種類的放線菌數(shù)量的減少甚至消失，自然條件下的土壤可能是獲得有潛在應用價值的源泉，因此加強自然環(huán)境保護。

4 結論

本研究采用了基于全長16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析的免培養(yǎng)技術，并結合放線菌門特異引物對平泉縣農(nóng)田土壤中放線菌多樣性進行了篩查。通過軟件分析說明本研究全面反應了土壤中放線菌的類群和數(shù)量。

構建了放線菌文庫并對平泉縣農(nóng)田土壤中放線菌多樣性進行了分析。596個放線菌序列歸屬于29個屬，17個科，12個亞目和2個亞綱，并確定了其優(yōu)勢菌屬，其中芽球菌屬（Blastococcus）（占放線菌總克隆數(shù)的12.75%），類諾卡氏菌屬（Nocardioides）（9.39%），節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）（8.72%），小月菌屬（Microlunatus）（5.37%），酸土單胞菌屬Aciditerrimonas（4.69%），沉積巖桿菌屬Ilumatobacter（3.35%）。

[1]Tan G Y A，Ward A C，Goodfellow M.Exploration of Amycolatopsis diversity in soil using genus-specific primers andnovelselectivemedia[J].SystApplMicrobiol，2006，29（7）：557-569.

[2]Maldonado L A，Stach J E M，Pathom-aree W，et al.Diversity of cultivable actinobacteria in geographically widespread marine sediments[J].Antonie van Leeuwenhoek，2005，87（1）：11-18.

[3]謝晴宜，洪葵.微生物資源的生物勘探[J].熱帶作物學報，2010，31（8）：1420-1426.

[4]Kumar Y，Aiemsum-Ang P，Ward A C，et al.Diversity and geographicaldistribution ofmembers ofthe Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gene clade detected by clade-specific PCR primers[J].Fems Microbiol Ecol，2007，62（1）：54-63.

[5]Schafer J，Jackel U，Kampfer P.Development of a new PCR primer system for selective amplification of Actinobacteria[J]. FEMS Microbiol Lett，2010，311（2）：103-112.

[6]Lane DJ.16S/23S rRNA Sequencing[J].Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematic，1990，5（10），115-117.

[7]James EM Stach.New primers for the class Actinobacteria：application to marine and terrestrial environments[J]. Environmental Microbiology，2003，5（10）：828-841.

[8]Stach JEM，Maldonado LA，Masson DG，et al.Statistical approaches for estimating actinobacterial diversity in marine sediments[J].Applied and Environmental Microbiology，2003，69（10）：6189-6200.

[9]Naruya Saitou，Masatoshi Nei.The neighbor-joining method：a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Mol Biol Evol，1987，4（4）：406-425.

[10]Normand P，Benson DR.Bergey’s manual of systematic bacteriology[M].New York：The Actinobacteria Springer，2012：508-510.

[11]Ahrens R，Moll G.Ein neues knospendes Bakterium aus der Ostsee[J].Mikrobiol，1970，70：243-265.

[12]Qin S.Isolation，diversity，and antimicrobial activity of rare actinobacteria from medicinal plants of tropical rain forests in Xishuangbanna，China[J].Appl Environ Microbiol，2009，75：6176-6186.

[13]Urzi C.Biodiversity of Geodermatophilaceae isolated from altered stones and monuments in the Mediterranean basin[J]. Environ Microbiol，2001（3）：471-479.

[14]Chuvochina MS.Community variability of bacteria in alpine snow（Mont Blanc）containing Saharan dust deposition and their snow colonisation potential[J].Microbes Environ，2011，26：237-247.

[15]Zhang S，Yang G，Wang Y，et al.Abundance and community of snow bacteria from three glaciers in the Tibetan Plateau[J].J Environ Sci（China），2010，22：1418-1424.

[16]Kubota M，Kawahara K，Sekiya K，et al.Nocardioides aromaticivorans sp.nov.，a dibenzofuran-degradingbacterium isolated from dioxin-polluted environments[J].Systematic and Applied Microbiology，2005，28：165-174.

[17]Schippers A，Schumann P.Nocardioides oleivorans sp.nov.，a novel crude-oil-degrading Bacterium[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55：1501-1504.

[18]Yoon JH，Cho YG，Lee ST，et al.Nocardioides nitrophenolicus sp.nov.a pnitrophenol degrading bacterium[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49：675-680.

[19]Yoon JH，Rhee SK，Lee JS，et al.Nocardioides pyridinolyticus sp.Nov.a pyridinedegrading bacterium isolated from the oxic zone of an oil shale column[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1997，47（4）：933-938.

[20]Topp E，Mulbry WM，Zhu H，et al.Characterization of striazine herbicide metabolism by a Nocardioides sp.isolated from agricultural soils[J].Applied and Environmental Microbiology，2000，66（8）：3134-3141.

[21]Hamamura N，Arp DJ.Isolation and characterization of alkane-utilizing Nocardioides sp.strain CF8[J].Fems Microbiology Letters，2000，186：21-26.

[22]Gesheva V，Vasileva-Tonkova E.Production of enzymes and antimicrobial compounds by halophilic Antarctic Nocardioides sp.grown on different carbon sources[J].World J Microbiol Biotechnol，2012，28（5）：2069-2076.

[23]李海雷，孫宏春，張奇志，等.節(jié)桿菌屬甲基對硫磷的降解菌株L-W的分離及降解特性[J].核農(nóng)學報，2008，22（2）：192-196.

[24]葉明，陳九山，姚曉慶.一株草甘膦降解菌分離鑒定及其降解特性研究[J].環(huán)境科學與技術，2009，32（3）：39-41.

[25]李戀，鄭金偉，杭寶劍，等.菊酯類殺蟲劑降解菌JZL-3（Arthrobacter sp.）的分離鑒定與降解特性研究[J].安全與環(huán)境學報，2010，10（6）：67-71.

[26]顧貴洲，王戰(zhàn)勇，于泳，等.石油降解菌株的篩選及鑒定[J].遼寧石油化工大學學報，2007，27（1）：24-26.

Screening of species diversity of farmland soil Actinomyces in pingquan，Hebei province

ZHANG Dong，ZHANG Xiao-yu，TANG Hui，ZHANG Xiu-min，ZHANG Li-ping*
（College of Life Science，Hebei University，Key Lab of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province，Baoding 071002，China）

In this study，farmland soil in Pingquan，Hebei province was revealed rich species diversity of actinomycetes.Culture-independent approach and 16S rRNA gene library were used in experiment process. Analyses of 596 sequences in 16S rRNA library of these actinomycetes showed that there were 29 genera，17 families，12 suborder，and 2 suborders.The dominant were Blastococcus（12.75%），Nocardioides（9.39%），Arthrobacter（8.72%），Microlunatus（5.37%），Aciditerrimonas（4.69%），and Ilumatobacter（3.35%）.The data enriched the resources and ecological function of actinomycetes，which offered a strong support in species diversity.

16S rRNA；actinobacteria；clone library

TS201.3

A

1002-0306（2014）08-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.036

2013－11－28 *通訊聯(lián)系人

張棟（1987－），男，碩士研究生，研究方向：基因工程改造和微生物多樣性研究。

國家自然科學基金（30970010）。