李 帥，郭玉蓉，鄭文龍，張 娟，蔣 蓮，張曉瑞

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

玉米粉對蘋果鮮渣發(fā)酵的影響及發(fā)酵分析

李 帥，郭玉蓉*，鄭文龍，張 娟，蔣 蓮，張曉瑞

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

以蘋果鮮渣為主要原料，添加玉米粉及混合微生物發(fā)酵劑，在28℃條件下進行固態(tài)發(fā)酵10d。采用平板稀釋法對發(fā)酵產(chǎn)物的微生物組成及安全性進行分析，通過比較不同配比發(fā)酵組的理化指標(biāo)得到，當(dāng)玉米添加量為10%時，最為合理。發(fā)酵渣主要包括酵母菌、乳酸菌和醋酸菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的，且發(fā)酵渣中蛋白質(zhì)的氨基酸組成較為合理。

蘋果鮮渣，玉米粉，固態(tài)發(fā)酵

我國是濃縮蘋果汁的生產(chǎn)大國，每年排出的鮮蘋果鮮渣有100多萬t，蘋果鮮渣是一種富含各種營養(yǎng)成分、工業(yè)附加值高、可綜合利用的農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)物[1-5]。近年來，蘋果鮮渣發(fā)酵利用得到越來越多的研究和重視，并且取得了初步的進展[6]。蘋果鮮渣中可發(fā)酵糖含量不高[7]，使得目標(biāo)菌在發(fā)酵初期被抑制，進而導(dǎo)致發(fā)酵過程產(chǎn)酸不足，不能抑制霉菌和其他雜菌的生長。因此發(fā)酵原料中需要添加其他發(fā)酵基質(zhì)，為發(fā)酵的順利進行提供必需的營養(yǎng)。

玉米是我國主要農(nóng)作物之一，在淀粉酶的作用下，玉米中的淀粉得到降解，可利用的寡糖單糖的含量顯著增加[8]；在蛋白酶的作用下，難溶的大分子蛋白水解為低分子量易溶的小分子蛋白或各種氨基酸，從而使可溶性蛋白質(zhì)含量上升；從理論上講這些成分都可以對菌體的增殖代謝起到促進的作用并對發(fā)酵過程和發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生積極的影響，有利于發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的改善[9]。因此本實驗以玉米粉為添加料，為目標(biāo)菌在發(fā)酵初期的生長提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。研究首先對發(fā)酵渣的安全性進行了分析比較，其次比較了不同配比的發(fā)酵產(chǎn)物中的理化指標(biāo)及氨基酸含量，最終篩選出了最佳發(fā)酵配比，同時監(jiān)測了發(fā)酵過程中糖酸及pH變化趨勢，初步探討了發(fā)酵工藝，為鮮蘋果鮮渣發(fā)酵利用提供了一種可行、有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果鮮渣 由陜西恒興果汁飲料有限公司提供；玉米粉 粉碎顆粒為80目；混合微生物發(fā)酵劑（主要含有酵母菌、乳酸菌及醋酸菌） 由陜西大秦漢生物有限公司提供；纖維素1酶（10000IU/g） 武漢新華揚公司；氫氧化鈉、硫酸、鹽酸、硫酸鉀、硫酸銅、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞等 均為分析純。

電子天平 德國賽多利斯集團；SW-CJ-1F型超凈工作臺 上海躍進醫(yī)療器；LDZX-40AI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；GSP-9080型恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；pHS-3C型pH計 雷磁上海儀電科學(xué)有限公司；Kjeltec 2300型全自動凱氏定氮儀 瑞典福斯公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本HITACHI公司，無菌塑料袋，培養(yǎng)皿，水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵原料配比及篩選 本實驗選擇玉米面粉作為添加料，同時添加0.5g/kg的纖維素酶。以5kg為單位進行發(fā)酵，混合菌種添加量為1g/kg，在28℃恒溫條件下發(fā)酵10d。對0、5%、10%和15%玉米添加量的發(fā)酵果渣進行比較，除去霉變發(fā)酵組后對發(fā)酵果渣進行微生物及理化分析。比較發(fā)酵前后微生物及蛋白質(zhì)等的變化，并在各組之間進行對比。

1.2.2 微生物組成分析 按照無菌操作要求對蘋果鮮渣微生物組成進行分析，發(fā)酵結(jié)束后對外觀未發(fā)生霉變的處理進行同樣的微生物組成分析，比較發(fā)酵前后微生物組成變化。均采用稀釋平板涂抹法[10]：霉菌和酵母菌分離測數(shù)采用改良PDA培養(yǎng)基（PDA瓊脂+1.0g/L酵母膏，倒皿前加體積分數(shù)0.3%的滅菌乳酸，調(diào)整pH為4.5）；放線菌分離測數(shù)采用高氏1號瓊脂培養(yǎng)基；細菌總數(shù)測定采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.3 理化指標(biāo)分析 粗蛋白測定：凱氏定氮法，參照GB/T 5511-1985；氨基酸組成測定：參照GB 7649-1987；粗脂肪測定：索氏提取法，參照GB/T 5499-1985；粗纖維測定：參照GB 5009.10-1985；粗灰分測定：參照GB/T 5505-1985；水分測定：105℃恒重法；總酸測定（以乙酸計）：酸堿滴定法；還原糖測定：斐林試劑滴定法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵配比的初步篩選

按照玉米添加量0、5%、10%和15%將發(fā)酵分為四組，每組做平行處理5份，在28℃條件下發(fā)酵10d，發(fā)酵結(jié)束后，各組霉變情況如表1所示。

表1 5種不同玉米添加量條件下的霉菌生長情況Table 1 Mold colony forming in varied adding of maize flour

由表1可以看出，未添加玉米粉的發(fā)酵組全部發(fā)生霉變，這表明單獨果渣發(fā)酵不能進行，需要添加其他輔料；玉米粉添加量為5%時，發(fā)酵不穩(wěn)定，仍有部分發(fā)酵組發(fā)生霉變；而當(dāng)玉米粉的含量在10%及以上時，發(fā)酵結(jié)果穩(wěn)定，未出現(xiàn)霉變現(xiàn)象。

2.2 發(fā)酵前后微生物組成及安全性分析

2.2.1 發(fā)酵后微生物組成變化 由表2可以看出，鮮果渣存在一定數(shù)量的霉菌和酵母菌，并含有極少數(shù)的放線菌；蘋果鮮渣經(jīng)過發(fā)酵后，放線菌基本消失；當(dāng)玉米添加量大于10%時，發(fā)酵后的蘋果鮮渣中的霉菌也會消失，此時蘋果鮮渣中的主要微生物組分是酵母菌和細菌。

表2 發(fā)酵前后微生物組成變化Table 2 Changes of microbial community composition before and after fermentation

2.2.2 發(fā)酵后主要細菌的鑒定 發(fā)酵開始時接入的菌種的主要成分為酵母菌、乳酸菌和醋酸菌，因此為了進一步確定發(fā)酵后蘋果鮮渣中的細菌類型，對發(fā)酵渣中的細菌進行耐酸及厭氧性篩選，并最終篩選出了兩大類細菌。

圖1 耐酸性細菌在顯微鏡下觀察（1000×）Fig.1 Acid-fast bacterium under the microscope（1000×）

圖1是耐酸性細菌在顯微鏡下的形態(tài)，成橢圓或短桿狀；在平板培養(yǎng)形成表面光滑、突起的菌落；挑取單個菌落進行革蘭氏染色實驗，結(jié)果呈陰性；該菌種接種在CaCO3培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，菌落周圍有明顯的透明圈形成；在接有該菌的產(chǎn)酸液體（發(fā)酵液）中加入10g/L FeCl3后加熱，有紅褐色沉淀出現(xiàn)。因此判斷發(fā)酵后的耐酸性細菌是醋酸菌。

圖2 厭氧性細菌在顯微鏡下觀察（1000×）Fig.2 Anaerobe under the microscope（1000×）

圖2是厭氧性細菌在顯微鏡下形態(tài)，呈桿狀；平板培養(yǎng)形成表面光滑菌落；革蘭氏染色呈陽性；在厭氧條件下培養(yǎng)48h后，取1環(huán)涂抹于滴有體積分數(shù)為3%的H2O2的玻片上，無氣泡產(chǎn)生，表示該菌無過氧化氫酶；依據(jù)分離條件，形態(tài)，過氧化氫酶特性等特征，初步判斷該厭氧性細菌為乳酸菌。

2.2.3 發(fā)酵安全性評價 以上結(jié)果表明，發(fā)酵后果渣中的主要微生物組成為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌，它們都是有益菌，有助于動物消化并且能提高動物免疫力，進而能夠提高發(fā)酵果渣的營養(yǎng)價值。因此，發(fā)酵后的果渣不僅安全而且對動物有益。在后續(xù)的保存中，由于產(chǎn)酸細菌的存在，使得蘋果鮮渣的保存時間可以延長8～10個月。

2.3 理化指標(biāo)分析

通過微生物組成分析，得到了安全的發(fā)酵組成，對其進行進一步的理化指標(biāo)分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，發(fā)酵后的果渣與發(fā)酵前相比，粗蛋白和總酸含量有明顯的提高，粗灰分略有提高，而發(fā)酵后的粗纖維和粗脂肪含量較發(fā)酵前有所下降；不同配比的發(fā)酵組之間，理化指標(biāo)變化差別不大，這可能是因為發(fā)酵基質(zhì)濃度過大，使得菌體生長受到一定程度的抑制，另一方面，玉米添加量的增大使得發(fā)酵中的水分比例減少，也會在一定程度上影響發(fā)酵的進行[11]。因此，為了降低生產(chǎn)成本，應(yīng)該選用10%玉米的添加量即可。

2.4 發(fā)酵蘋果鮮渣氨基酸組成分析與營養(yǎng)評價

對發(fā)酵前后蘋果鮮渣中的必需氨基酸組成進行分析比較，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，發(fā)酵后的必需氨基酸含量比發(fā)酵前提高13%左右；當(dāng)玉米添加量大于10%后，玉米添加量的增加對必需氨基酸含量的影響不大，這可能是因為玉米添加量大于10%時，發(fā)酵渣中的微生物組成已經(jīng)達到穩(wěn)定，玉米已經(jīng)不再是影響發(fā)酵渣中微生物組成比例的主要因素。因此，根據(jù)理化指標(biāo)的變化，綜合生產(chǎn)成本。當(dāng)玉米添加量達到10%的時，發(fā)酵既安全穩(wěn)定，又節(jié)約經(jīng)濟，為發(fā)酵最佳配比。

2.5 發(fā)酵過程的監(jiān)測

圖3 還原糖含量變化圖Fig.3 Change of reducing suger in fermentation process

圖4 總酸含量變化圖Fig.4 Change of acidity in fermentation process

表3 不同玉米添加量果渣發(fā)酵前后理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical indexes in varied adding of maize flour before and after fermentation

表4 發(fā)酵前后必需氨基酸變化Table 4 Changes of content of essential amino acid before and after the fermentation

對最佳處理（即玉米添加量10%）進行發(fā)酵過程的監(jiān)測，其中包括還原糖含量、總酸（以乙酸計）含量和pH變化，結(jié)果如圖3～圖5所示。

由圖3可知，發(fā)酵過程是消耗還原糖的過程，在發(fā)酵開始的時候，由于纖維素酶的降解能力大于微生物的發(fā)酵能力，因此還原糖有上升的趨勢，當(dāng)降解結(jié)束，微生物快速繁殖，還原糖被微生物迅速利用，還原糖下降，發(fā)酵至第7～8d的時候，還原糖利用率基本穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束。

圖5 pH變化Fig.5 Change of pH in fermentation process

由圖4可以看出，發(fā)酵過程中，總酸含量不斷上升，隨著發(fā)酵的進行，酸度逐漸穩(wěn)定，最高達到50°T。結(jié)合細菌鑒定結(jié)果可以推斷，發(fā)酵過程中累積的酸以醋酸和乳酸為主，根據(jù)醋酸菌和乳酸菌的特性可以判斷，發(fā)酵初期微生物的代謝方式以有氧呼吸為主，當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)部達到無氧狀態(tài)時，醋酸菌和乳酸菌以無氧呼吸的方式發(fā)酵產(chǎn)酸，使得發(fā)酵渣中的酸度迅速上升。

由圖4和圖5可知，發(fā)酵過程中的pH變化與酸度變化相一致，酸度逐漸增加而pH逐漸減小，最終pH達到3.5以下，在此pH下，大部分的霉菌和腐生菌將無法生存，而醋酸菌和乳酸菌也達到發(fā)酵的終點，至此發(fā)酵結(jié)束。

圖3～圖5展示出了發(fā)酵過程中完整的糖酸變化過程，在以后的發(fā)酵中可以作為發(fā)酵正常進行的標(biāo)準(zhǔn)，為發(fā)酵的監(jiān)測提供保障。

3 結(jié)論

蘋果鮮渣添加玉米粉，經(jīng)混合菌種發(fā)酵后，沒有發(fā)生霉變及腐敗現(xiàn)象，蘋果鮮渣中的霉菌和放線菌基本消失，顏色呈淺黃色，有酒香、果香及特殊的發(fā)酵香氣。其微生物組成以酵母菌、醋酸菌和乳酸菌為主。發(fā)酵渣作為動物飼料，安全、有益。

蘋果鮮渣中添加10%的玉米，能夠保證發(fā)酵的正常進行，發(fā)酵產(chǎn)物中的營養(yǎng)物質(zhì)含量相對較高，同時生產(chǎn)成本最為經(jīng)濟。發(fā)酵蘋果鮮渣較未發(fā)酵蘋果鮮渣的必需氨基酸含量有明顯增加。

正常的發(fā)酵過程是消耗還原糖并產(chǎn)酸的過程，當(dāng)還原糖含量低于1%時，發(fā)酵接近終點。發(fā)酵過程中pH逐漸降低，并最終趨于穩(wěn)定。

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Effect of corn flour on fermentation of apple fresh pomace and analysis of fermentation

LI Shuai，GUO Yu-rong*，ZHENG Wen-long，ZHANG Juan，JIANG Lian，ZHANG Xiao-rui
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Apple fresh pomace was used as main materials，corn flour and mixed fermentation starter culture were also needed.The optimum condition for the fermentation of pomace was：cultivate temperature 28℃，cultivate time 10d.The method of plate dilution was used to analyze the microbial composition and safety of fermented product，through comparing the the physical and chemical indicators of different fermentation group. The fermentation was optimal when the addition of maize flour was 10%.The results showed that there were mainly yeast，lacto-bacilli and acetobacter in the fermentation residue.The model of amino acid composition of the protein was good.

apple fresh pomace；corn flour；solid-state fermentation

TS209

A

1002-0306（2014）08-0157-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.027

2013－08－13 *通訊聯(lián)系人

李帥（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-28）。