劉勝貴，張 靜，王頻藝，付 明

（懷化學(xué)院生命科學(xué)系，民族藥作植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南懷化418008）

顯齒蛇葡萄葉對食品防腐作用的研究

劉勝貴，張 靜，王頻藝，付 明

（懷化學(xué)院生命科學(xué)系，民族藥作植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南懷化418008）

為了研究顯齒蛇葡萄對食品的防腐效果，分別采摘3、7、11月份的顯齒蛇葡萄葉作為實驗材料，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金芽胞桿菌、藤黃八疊球菌和枯草芽胞桿菌五種微生物為實驗菌株，用藥敏紙片擴(kuò)散法測定不同生長時期的顯齒蛇葡萄葉抑菌圈直徑，通過二倍稀釋法測定MBC值，以平板菌落計數(shù)反映添加有不同提取物濃度的食品中微生物的生長狀況。結(jié)果表明7月份采摘的顯齒蛇葡萄提取物對金黃色葡萄球菌抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到27.0mm，MBC為5%；當(dāng)提取物濃度為4MBC時，肉湯食品抑菌時間延長達(dá)140h。顯齒蛇葡萄有廣譜抑菌作用，并且對豬肉、牛奶、西瓜和豆?jié){都有防腐作用。

顯齒蛇葡萄，水提取物，藥敏紙片擴(kuò)散法，二倍稀釋法，平板菌落計數(shù)法

顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）是葡萄科蛇葡萄屬中的一種野生藤本植物，主要分布于湖北、湖南、廣東、江西、福建、云南、貴州等省少數(shù)民族地區(qū)，是一種民間茶用藥用植物，已有上千年的應(yīng)用歷史[1]。根據(jù)民間長期的飲用實踐和現(xiàn)代科學(xué)研究證實，顯齒蛇葡萄具有生津止渴、甘喉潤肺、護(hù)肝益血、降虛火、助消化、消炎解毒、降壓減肥、潤膚美容等功效[2]，這些為顯齒蛇葡萄資源的開發(fā)利用提供了有價值的科學(xué)依據(jù)，也為對其進(jìn)行深度開發(fā)打下良好基礎(chǔ)。目前不少學(xué)者對顯齒蛇葡萄的藥理功能已進(jìn)行了一系列研究[3-7]。現(xiàn)階段對顯齒蛇葡萄抗菌作用的研究，已取得一定成績。但目前對不同生長時期顯齒蛇葡萄抑菌效果進(jìn)行比較以及測定其提取物內(nèi)溶物含量的相關(guān)研究還很少。本實驗運(yùn)用藥敏紙片法和二倍稀釋法對不同生長時期的顯齒蛇葡萄抑菌效果進(jìn)行比較，此外做了不同提取物濃度的食品防腐研究，旨在為食品保鮮，抗生素替換物等方面提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

顯齒蛇葡萄葉 于2011年4月、7月、11月采自湖南懷化康龍自然保護(hù)區(qū)；牛奶、豆?jié){、鮮豬肉、新鮮西瓜 均為市售；供試菌種 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CCTCCAB91053）、大腸桿菌（Escherichia coli O1）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea） 以上菌株均由懷化學(xué)院微生物學(xué)實驗室提供；LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基 蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g，用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH7.0，蒸餾水定容至1000mL；LB固體培養(yǎng)基 在LB液體培養(yǎng)基中加1.6%的瓊脂粉。

YXQ-LS-50S1立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-2000電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市華北實驗有限公司；CJ型水平層流凈化工作臺 蘇州潔凈技術(shù)研究所制造；SIGMA3K-18型離心機(jī) 德國SIGMA公司；RE5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海廣英儀器有限公司；SHZD（Ⅲ）循環(huán)式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；FD-1C冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 顯齒蛇葡萄提取物的制備 顯齒蛇葡萄提取物制備按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行改進(jìn)。將顯齒蛇葡萄葉洗凈，于60℃恒溫箱中烘干至恒重，用組織粉碎機(jī)粉碎后，稱取4、7、11月葉粉末各40g，分別加入200mL蒸餾水，待煮沸后再用文火煎30min，濾出煎液，在濾渣中加100mL蒸餾水再用文火煎20min，把兩次煎液混合，于4000r/min離心4min，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至100mL，去除沉淀，真空冷凍干燥成粉末，在干燥箱中貯藏備用。

1.2.2 菌懸液制備 菌懸液制備方法按文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。將供試菌種分別接種在LB固體培養(yǎng)基上，37℃活化培養(yǎng)24h，挑取活化后的菌落與無菌生理鹽水中混合，并用生理鹽水調(diào)至0.5 McFarland單位的標(biāo)準(zhǔn)接種物，即為1×108～2×108CFU/mL的菌懸液濃度。

1.2.3 抗微生物活性實驗 抗微生物活性實驗按文獻(xiàn)[10]進(jìn)行改進(jìn)。分別將3個樣品的顯齒蛇葡萄提取物粉末用蒸餾水配制成10%的濃度，再滅菌[11]。將濾紙打成直徑為6mm的圓形濾紙片，滅菌、烘干后放入顯齒蛇葡萄提取物中充分浸泡，取出后低溫烘干，制成藥敏紙片。吸取0.1mL濃度為1×108～2×108CFU/mL的菌懸液于含LB固體培養(yǎng)基的平板中央，將菌液均勻涂布于平板上。含菌平板倒置干燥約30min后，用鑷子取藥敏紙片均勻貼在平板上，每個平板貼3個藥敏紙片，相對應(yīng)地貼好標(biāo)簽。20min后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，測量抑菌圈直徑。以上實驗重復(fù)三次。

1.2.4 最低殺菌濃度（MBC）測定 MBC的測定按文獻(xiàn)[12]進(jìn)行改進(jìn)。將顯齒蛇葡萄提取物制成倍比稀釋的系列試管。然后向各管中加入0.1mL濃度為1×108～2×108CFU/mL的細(xì)菌懸液，培養(yǎng)24h后取上述試管中0.1mL培養(yǎng)物涂布于LB固體培養(yǎng)基的平板，再置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察培養(yǎng)物生長情況，沒有菌生長的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度（MBC）。

1.2.5 不同提取物濃度的食品制備 牛奶和豆?jié){加熱煮沸后4℃冰箱保存?zhèn)溆?。鮮豬肉用搗碎機(jī)搗碎成泥后，加100mL蒸餾水，用文火煮50min后取湯汁，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｐ迈r西瓜在無菌條件下打開取汁，將上述食品配制成含7月份顯齒蛇葡萄提取物的溶液，使其濃度達(dá)到0、1、2、3、4MBC，裝入容器中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 食品防腐實驗 按文獻(xiàn)[13]進(jìn)行改進(jìn)。將配制好的不同濃度的提取物食品分裝入大試管中，每支試管10mL，共20支試管，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從0時間開始，每隔4小時取樣一次，每次取0.1mL溶液涂布于LB培養(yǎng)基的平板中央，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h。觀察細(xì)菌生長情況，并通過菌落計數(shù)法來記錄細(xì)菌的生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同生長時期顯齒蛇葡萄抑菌效果

通過三次重復(fù)的藥敏紙片實驗，得到顯齒蛇葡萄提取物抑菌圈直徑的平均值，結(jié)果如表1所示。

表1 不同生長時期顯齒蛇葡萄對五種菌種的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of the extracts of A.grmsedntara in different growth stages on five bacterial strains

顯齒蛇葡萄提取物對所有供試菌都顯示了抗菌活性。對金黃色葡萄球菌抑菌作用最強(qiáng)，其中7月份的顯齒蛇葡萄提取物的抑菌圈直徑達(dá)到27.0mm；其次是大腸桿菌；而對枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和藤黃八疊球菌抑菌活性相對較弱。三個不同生長時期的顯齒蛇葡萄提取物抑菌效果最強(qiáng)的是7月份的顯齒蛇葡萄，抑菌效果最弱的是11月份的顯齒蛇葡萄。

2.2 顯齒蛇葡萄最低殺菌濃度（MBC）

以7月份顯齒蛇葡萄提取物配倍比系列稀釋溶液，對5種供試菌種的最低殺菌濃度進(jìn)行了測定，如表2所示。

表2 7月份顯齒蛇葡萄提取物對5種細(xì)菌的MBC值Table 2 MBCs of the extracts of A.grossedentata which collected in July against five bacterial strains

7月份顯齒蛇葡萄提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌效果最強(qiáng)，MBC為5%，對枯草芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌效果最弱，MBC為20%。

2.3 顯齒蛇葡萄提取物在食品防腐中的效果

2.3.1 牛奶食品 將含有0、1、2、3、4倍MBC顯齒蛇葡萄提取物的牛奶食品放置136h，定期取樣進(jìn)行平板涂布，觀察細(xì)菌生長情況，結(jié)果見圖1。

圖1 顯齒蛇葡萄提取物的牛奶食品抑菌曲線Fig.1 Bactericidal curves of extracts of the extracts of A.grossedentata in milk

由圖1可知，含1MBC、2MBC濃度顯齒蛇葡萄提取物的牛奶食品防腐效果不強(qiáng)，延長抑菌時間均為4h，1MBC在4～8h呈對數(shù)生長，2MBC在4～16h呈對數(shù)生長，16～32h間對數(shù)值在5.16～6.10間小幅度增加；3MBC有較好的抑菌效果，延長抑菌時間為24h，在24～72h呈對數(shù)生長；4MBC濃度的牛奶食品防腐效果最明顯，可延長食品抑菌時間至80h。

2.3.2 豆?jié){食品 按方法2.3.1，將配制不同濃度的顯齒蛇葡萄提取物的豆?jié){食品放置114h，定期取樣進(jìn)行平板涂布，觀察細(xì)菌生長情況，結(jié)果見圖2。

圖2 顯齒蛇葡萄提取物的豆?jié){食品抑菌曲線Fig.2 Bactericidal curves of extracts of the extracts of A.grossedentata in soy milk

不同提取物濃度的豆?jié){食品防腐效果不同。其中1MBC、2MBC濃度的豆?jié){食品效果接近，均可延長食品抑菌時間4h，但2MBC對數(shù)值的增長速率較1MBC?。?MBC有一定的抑菌效果，延長食品抑菌時間12h，在12～40h細(xì)菌生長的對數(shù)圖成拋物線，對數(shù)值的增長速率逐漸減小；4MBC濃度的豆?jié){食品可延長食品抑菌時間48h，在48～90h細(xì)菌呈對數(shù)生長，其對數(shù)值的增長速率最小。

2.3.3 西瓜食品 按方法2.3.1，將配制不同濃度的顯齒蛇葡萄提取物的西瓜食品放置94h，定期取樣進(jìn)行平板涂布，觀察細(xì)菌生長情況，結(jié)果見圖3。

圖3 顯齒蛇葡萄提取物的西瓜食品抑菌曲線Fig.3 Bactericidal curves of extracts of the extracts of A.grossedentata in watermelon

其中1MBC濃度的西瓜食品沒有明顯的抑菌效果，基本上不能延長抑菌時間；2MBC和3MBC濃度的西瓜食品防腐效果較明顯，分別延長食品抑菌時間約8h、12h，在12～32h間3MBC的細(xì)菌生長對數(shù)曲線呈拋物狀，細(xì)菌生長的對數(shù)值增加速率逐漸減慢；4MBC抑菌效果最好，延長抑菌時間可達(dá)64h，在64～72h呈對數(shù)增長，其對數(shù)值的增長速率最小。

2.3.4 肉湯食品 按方法2.3.1，將配制不同濃度的顯齒蛇葡萄提取物的肉湯食品放置180h，定期取樣進(jìn)行平板涂布，觀察細(xì)菌生長情況，結(jié)果見圖4。

圖4 顯齒蛇葡萄提取物的肉湯食品抑菌曲線Fig.4 Bactericidal curves of extracts of the extracts of A.grossedentata in pork

1MBC濃度的肉湯食品有一定抑菌效果，能延長抑菌時間至12h，在12～20h內(nèi)細(xì)菌生長對數(shù)值呈直線增長；2MBC和3MBC的抑菌效果差異不顯著，延長抑菌時間均為16h左右，2MBC濃度的食品細(xì)菌生長對數(shù)值呈拋物線增長，比1MBC的對數(shù)值增長速率大，3MBC比2MBC的對數(shù)值增長速率小，在20～32h間對數(shù)值在2.97幅度間增加；4MBC濃度的肉湯食品防腐效果最強(qiáng)，可延長食品抑菌時間至140h。

3 結(jié)論與討論

長期以來，在食品工業(yè)中都習(xí)慣于使用化學(xué)合成品作為食品防腐劑，如苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類和對羥基苯甲酸酯類等，但這些化學(xué)合成的食品防腐劑在使用過程中或多或少地會對食品的風(fēng)味產(chǎn)生一定的不良影響；更重要的是這些防腐劑在食品加工中的添加量都比較大，容易超標(biāo)使用而對人體產(chǎn)生毒副作用。近年來天然防腐劑的研究和開發(fā)利用成為了食品工業(yè)的一個熱點(diǎn)。本文研究結(jié)果表明，顯齒蛇葡萄對牛奶、豆?jié){、西瓜、肉湯等常見食品有不同程度的抑菌作用，當(dāng)提取物濃度達(dá)到4MBC對牛奶、肉湯的殺菌作用可以分別達(dá)到80和140h，抑菌效果十分明顯，表明顯齒蛇葡萄是一種有開發(fā)潛力的天然防腐劑。顯齒蛇葡萄顯齒蛇葡萄能作為添加劑應(yīng)用到食品中的有效成分活性非常高，提取工藝簡單，成本低，且價值化技術(shù)日漸成熟，隨著研究的不斷深入，顯齒蛇葡萄及其提取物在食品防腐和制藥原料將有廣闊的應(yīng)用前景。但由于顯齒蛇葡萄提取物顏色較深，對風(fēng)味也有一定的影響，添入食品中會影響食品的色、香、味，因此，要將顯齒蛇葡萄開發(fā)成新的天然食品防腐劑，還需要進(jìn)一步研究其有效成分的提取和加工。

[1]陳玉瓊.藤茶中黃酮二氫楊梅素的提取分離降血脂作用及藤茶安全評價研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[2]張曉曉.顯齒蛇葡萄浸提動態(tài)及其飲料開發(fā)的研究[D].長沙：中南林學(xué)院，2003.

[3]熊皓平.顯齒蛇葡萄生化成分分析及抑菌作用的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[4]沈露.超臨界CO2流體技術(shù)萃取藤茶中二氫楊梅素及抑菌活性的研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2006.

[5]鐘正賢，覃潔萍，周桂分.廣西瑤族藤茶中雙氫楊梅素皮素的藥理研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，1998，4（3）：42-44.

[6]張友勝，楊偉麗，熊皓平.顯齒蛇葡萄基本成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13（5）：46-48.

[7]曾維超.藤茶加工新工藝的研究[D].武漢：武漢大學(xué)，2006.

[8]劉勝貴，彭斯文，閩丹.18種抗炎中草藥的抑菌作用研究[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2007，27（2）：41-43.

[9]Rabe T，Van J.Antibacterial activity of South African plants used for medicinal purposes[J].Ethnopharmacol，1997，56：81-87. [10]Frank M Frey，Ryan Meyers.Antibacterial activity of traditional medicinal plants used by Haudenosaunee peoples of New York State[J].BMC Complementary and Alternative Medicine，2010，10：64.

[11]熊皓平.顯齒蛇葡萄生化成分分析及抑菌作用的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[12]付明，劉勝貴，伍賢進(jìn).灰白毛霉，蒼耳的抑菌作用研究[J].華中師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，39（2）：245-248.

[13]張緒忠，陳青山，程光文.苦瓜抑菌防腐作用的實驗研究[J].武漢冶金科技大學(xué)學(xué)報，1996，19（3）：18.

Application on food preservation of Ampelopsis grossedentata leaves

LIU Sheng-gui，ZHANG Jing，WANG Pin-yi，F(xiàn)U Ming
（The Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of HUnan Province，Department of Life Sciences，Huaihua University，Huaihua 418008，China）

To research the application on food preservation of extract of Ampelopsis grossedntata，the leaves of A.grossedentata that were collected in March，July and November were taken as experimental materials，respectively.Escheridhia coli，Staphylococcus aureus，Bacillus thuringiensis，Sarcina lutea and Bacillus subtilis were taken as experimental strains.After the different bacteria were dealed with leaves extracts of A. grmsedntara，the inhibitory zone diameters were evaluated by using a disk-diffusion and the minimum bactericidal concentrations（MBC）were detected by double dilution method during the process of bacterial growth.Microorganisms in the food solution，which were related to different concentrations of the extracts，were quantified by colony counting method.The results showed the extracts from the leaves of A.grossedentata were collected in July had the strongestantibacterial effect on S.aureus，the inhibitory zone diameter reached 27.0mm and MBC was only 5%.Bacteriostatic time for broth food could reach 140h when the concentration of the extracts was 4MBC.This indicated the extracts from the leaves of A.grossedentata had broad antimicrobial spectrum and good preservative effect on pork，milk，watermelon and soy milk.

Ampelopsis grossedentata；water extracts；drug sensitive slips method；double dilution method；plate culture count method

TS201.3

A

1002-0306（2014）08-0118-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.017

2013－08－14

劉勝貴（1965-），男，碩士研究生，主要從事食品微生物學(xué)教學(xué)與研究方面的工作。

湖南省教育廳科研項目（11C0988）；湖南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項目資助。