李宇寧，徐冉行，劉東海

斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA的臨床研究

李宇寧，徐冉行，劉東海

目的探討斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA的應(yīng)用價(jià)值。方法設(shè)計(jì)mecA基因特異性引物，用地高辛標(biāo)記；制備mecA基因探針，運(yùn)用斑點(diǎn)雜交方法、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)mecA基因。結(jié)果100例臨床分離的金黃色葡萄球菌中共檢出mecA基因陽(yáng)性32例，陽(yáng)性率為32%；PCR方法檢出陽(yáng)性36例，陽(yáng)性率為36%。結(jié)論通過(guò)斑點(diǎn)雜交技術(shù)可以方便、特異地檢測(cè)出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因。

微生物敏感性試驗(yàn)；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；斑點(diǎn)雜交；mecA基因

近年來(lái)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的感染率不斷呈上升趨勢(shì)，MRSA的耐藥機(jī)制較復(fù)雜，目前認(rèn)為的機(jī)制主要有：染色體介導(dǎo)的固有耐藥、通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移獲得性耐藥及基因表達(dá)調(diào)控異常性耐藥等。mecA基因是MRSA特有的耐藥基因，在MRSA耐藥機(jī)制中起到?jīng)Q定性的作用，該基因編碼耐藥菌特異的青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a），從而造成細(xì)菌耐藥。本文進(jìn)行了地高辛標(biāo)記mecA基因探針的研究，并與聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法比較，評(píng)價(jià)其對(duì)mecA基因直接檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料100例金黃色葡萄球菌菌株均分離自寧波市第六醫(yī)院2010年5月至2012年7月住院患者的臨床標(biāo)本。所有菌株經(jīng)常規(guī)生化鑒定，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213。引物合成mecA基因的PCR引物參照參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[1]，上游引物為：5'-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA-3'，下游引物為：5'-CCAATTCCACATTGTITCGGTCTAA-3'，由上海英俊公司合成。

1.2 主要試劑和儀器地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記探針試劑、雜交液及尼龍膜等購(gòu)自Roche公司，PCR試劑及測(cè)序由上海生工生物工程有限公司提供，細(xì)菌鑒定儀為生物梅里埃ATB Expression，PCR擴(kuò)增儀為中山達(dá)安DA7600。

1.3 方法

1.3.1 地高辛（DIG）隨機(jī)引物法標(biāo)記CGI-100基因探針提取用質(zhì)控菌株ATCC29213的DNA樣品，用該DNA作為模板，用mecA特異性引物擴(kuò)增mecA片段，PCR總體積為25 l，其中10×PCR Buffer 2.5l，10 m mol/L dNTP mixture 2.0 l，TaKaRa LA Taq酶0.16 l，上下游引物各1 l，25 mmol/L MgCl22.0 l，模板DNA 1.5 l無(wú)菌水補(bǔ)足至25 l。擴(kuò)增條件為：94℃2min，94℃30s，50℃30 s，72℃50 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。取20 l PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，按照膠回收試劑盒回收純化，用分光光度計(jì)測(cè)定CGI-100基因的濃度和純度，取CGI-100基因DNA0.8 g，無(wú)菌水補(bǔ)充至16 l，在沸水中變性10min，加入DIG隨機(jī)引物法標(biāo)記試劑（Roche公司），在37℃標(biāo)記12 h。

1.3.2 標(biāo)記探針效率的檢測(cè)嚴(yán)格按照Roche公司提供的說(shuō)明進(jìn)行，將對(duì)照DNA與待檢測(cè)的DNA點(diǎn)在尼龍膜上，免疫顯色后對(duì)比分析探針標(biāo)記效率。將標(biāo)記好的探針?lè)胖猫D20℃保存。

1.3.3 金黃色葡萄球菌標(biāo)本DNA樣品的提取各樣本細(xì)菌DNA的提取參照文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[2]，在血平板上生長(zhǎng)的金黃色葡萄球挑取菌落，放入無(wú)菌0.9%氯化鈉注射液中，離心棄去上清液，沉淀中加入蛋白酶K裂解液與溶葡萄球菌素，混勻，37℃孵育30 min，離心取上清即為DNA。

1.3.4 PCR法檢測(cè)各標(biāo)本中mecA基因片段PCR體系與反應(yīng)條件同上1.3.1步驟，最后取5.0 l PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳（170 V，20 min）鑒定。

1.3.5 斑點(diǎn)雜交用分光光度計(jì)測(cè)定各標(biāo)本DNA的濃度和純度，利用點(diǎn)樣器依次點(diǎn)在尼龍膜上，每個(gè)樣本2.0 g，固定、雜交、免疫顯色均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)。＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)mecA結(jié)果在100例金黃色葡萄球菌中，共檢出mecA基因陽(yáng)性36例，陽(yáng)性率為36%。見(jiàn)封四彩圖4。

2.2 斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)mecA結(jié)果共檢測(cè)出mecA基因陽(yáng)性32例，陽(yáng)性率為32%，與PCR檢出陽(yáng)性率比較，采用斑點(diǎn)雜交檢出的32例陽(yáng)性標(biāo)本，PCR法檢測(cè)出31例陽(yáng)性，有1例為陰性，在瓊脂糖凝膠電泳上觀察到此例的PCR電泳條帶模糊且位置不符合故被認(rèn)為是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，后經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)是mecA陽(yáng)性標(biāo)本，而PCR法另外5例陽(yáng)性標(biāo)本，采用斑點(diǎn)雜交法為陰性結(jié)果。見(jiàn)封四彩圖5。

2.3 陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)對(duì)100例金黃色葡萄球菌mecA基因進(jìn)行檢測(cè)，斑點(diǎn)雜交法共檢出32例陽(yáng)性，PCR方法共檢出36例陽(yáng)性，兩種方法陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=0.36，＞0.05）。

3 討論

自1961年英國(guó)首次報(bào)道MRSA以來(lái)，其感染率逐年上升，在我國(guó)關(guān)于MRSA相關(guān)的報(bào)道也很多[3-4]。研究表明：金葡菌對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制主要有兩種，其一是金葡菌可產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，其二是該菌可以產(chǎn)生過(guò)量的青霉素結(jié)合蛋白（PBPS）。以上兩種耐藥現(xiàn)象可以提高抗生素的藥物劑量而解除[5]。MRSA是院內(nèi)感染的重要病原菌，主要耐藥機(jī)制是mecA基因編碼低親和力的青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a）所致。在-內(nèi)酰胺類抗生素存在的情況下，當(dāng)其他的PBP被抑制而不能發(fā)揮正常生理效應(yīng)時(shí)，PBP2a可代替被抑制的PBP發(fā)揮作用，導(dǎo)致細(xì)菌生存而耐藥[6]。

國(guó)外已將mecA基因測(cè)定作為MRSA的確診實(shí)驗(yàn)，因此檢測(cè)mecA基因的存在與否可作為MRSA感染觀察的一種分子標(biāo)志物[7]。目前，苯唑西林紙片擴(kuò)散法是美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的鑒定MRSA的常用方法，但該法影響因素較多，準(zhǔn)確性較差[7]。利用地高辛標(biāo)記基因探針檢測(cè)基因的文獻(xiàn)報(bào)道較多[8-9]。本研究采用地高辛標(biāo)記部分mecA基因序列，制備了用于檢測(cè)mecA基因的DNA探針，經(jīng)對(duì)照鑒定其檢測(cè)靈敏度為0.1 pg，完全符合雜交實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)100例金葡菌mecA基因檢測(cè)可知：斑點(diǎn)雜交法與PCR法兩者的陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而5例PCR法為陽(yáng)性，斑點(diǎn)雜交法為陰性的標(biāo)本，經(jīng)DNA測(cè)序確為mecA陰性標(biāo)本，說(shuō)明PCR法存在一定的假陽(yáng)性率。因斑點(diǎn)雜交采用了特異性DNA探針，故斑點(diǎn)雜交和PCR方法相比較，其特異性前者高，靈敏度后者較高。

綜上所述，雖然PCR技術(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)mecA的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但當(dāng)PCR產(chǎn)物條帶不能確定是特異性帶還是非特異性帶時(shí)，斑點(diǎn)雜交有助于特異性鑒定，由于雜交技術(shù)是以核酸堿基嚴(yán)格配對(duì)為前提的，因此斑點(diǎn)雜交還可以初步篩選待檢基因的突變情況，對(duì)了解細(xì)菌的耐藥機(jī)制有一定意義。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.12.068

R446.5

A

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