張浩 馮琳琳

北京小湯山醫(yī)院，北京102211

基因指導(dǎo)的華法林用藥研究

張浩 馮琳琳

北京小湯山醫(yī)院，北京102211

目的回顧性研究基于CYP2C9*3和維生素K環(huán)氧化物還原酶亞單位1（VKORC1）1639基因分型結(jié)果計算的華法林維持劑量與實(shí)際劑量的相關(guān)性，并依據(jù)該方法進(jìn)行前瞻性個體化給藥研究。方法使用華夏時代的快速基因分析方法，檢測患者華法林相關(guān)的基因類型，并結(jié)合患者年齡、身高和體重根據(jù)國際華法林藥物遺傳學(xué)協(xié)會（IWPC）公式計算華法林的初始給藥劑量和理論維持劑量。對63、20例患者標(biāo)本分別進(jìn)行了回顧性和前瞻性研究，計算理論維持劑量與患者實(shí)際維持劑量，使用SPSS統(tǒng)計分析軟件對二者進(jìn)行相關(guān)性研究分析。結(jié)果回顧性研究結(jié)果說明依據(jù)基因檢測結(jié)果的建議維持劑量和實(shí)際維持劑量相關(guān)性達(dá)到42.7%。進(jìn)一步的前瞻性研究結(jié)果中約35%的患者建議維持劑量基本吻合于實(shí)際維持劑量。結(jié)論這種基于快速基因分析的華法林用藥劑量的計算具有很高的臨床價值，可用于指導(dǎo)華法林個體化治療。

華法林；VKORC1；CYP2C9?3

華法林是目前廣泛應(yīng)用的香豆素類口服抗凝藥，其主要用于預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病以及骨關(guān)節(jié)置換、腦梗死和心臟支架手術(shù)術(shù)后康復(fù)等。因其療效明確、價格便宜而廣泛使用。但是由于華法林的個體治療范圍很窄，劑量受各種因素影響而分布很廣，不同個體所需的維持劑量差異可能達(dá)到十?dāng)?shù)倍。如果服用過量則可出現(xiàn)致命性出血，而過低則無法達(dá)到抗凝效果，有血栓風(fēng)險。臨床上，醫(yī)生需根據(jù)凝血酶原時間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）多次調(diào)整華法林劑量，因而合適的劑量較難達(dá)到。影響華法林用藥劑量的因素主要分為遺傳因素和非遺傳因素，在遺傳因素中基因維生素K環(huán)氧化物還原酶亞單位1（VKORC1）（1639G-A）和CYP2C9*3位點(diǎn)突變與否將對華法林用量產(chǎn)生較大的影響[1]。有研究顯示CYP2C9基因的突變型CYP2C9*3，其編碼的酶活性比野生型CYP2C9*1降低了80%[2]。而VKORC1啟動子上基因位點(diǎn)（-1639G＞A）的突變與否也和華法林的劑量密切相關(guān)[3]。在亞洲人群中CYP2C9*3和VKORCl（1639G-A）的突變比例則分別達(dá)到了4.55%和7.59%左右[4]，因而對于這兩個位點(diǎn)的多態(tài)性檢測更具備臨床指導(dǎo)意義。

目前華法林相關(guān)基因位點(diǎn)的測序方法主要有sanger雙脫氧終止法[5]（常規(guī)測序）和焦磷酸測序法等。這些測序方法的報告結(jié)果需一至數(shù)天，不便于等待服用華法林的患者。而快速的基因檢測方法可以縮短出報告的時間。本研究使用微測序基因檢測技術(shù)，僅檢測具有臨床意義的基因多態(tài)性位點(diǎn)的堿基類型，這樣可以在很大程度上減少檢測時間，更快地出具檢測結(jié)果，第一時間提供給臨床。使用本方法可以最快在3 h內(nèi)出結(jié)果，更有利于華法林用藥的臨床個體化治療的開展。

近來關(guān)于華法林藥物相關(guān)基因的研究很多，但都是停留在回顧性研究基因表型在人群分布、公式推導(dǎo)劑量和病例記錄劑量的吻合程度等，真正進(jìn)行基因型檢測后參與指導(dǎo)臨床用藥的研究報道較少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該試劑盒的檢測方法進(jìn)行了部分回顧性研究，并前瞻性參與了指導(dǎo)華法林患者的臨床用藥，研究基因指導(dǎo)用藥過程中存在的問題及臨床意義。本研究的結(jié)論可以為之后開展基因指導(dǎo)的臨床個體化用藥提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑DNA測序系列試劑盒（北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司）：預(yù)處理液：10 mL/瓶（10×保存液）；耀金保：10 mL/瓶（PHARM-GENE 01 SNP分析保存液）；耀金分：25 μL/支，30支/盒（PHARM-GENE 200 SNP分析樣本處理試劑）。滅菌注射用水：5 mL/瓶（國藥集團(tuán)容生制藥有限公司）。離心管：1.5 mL。移液吸頭：0.5～10 μL、200 μL、1000 μL（Axygen不帶濾芯）。

1.1.2 儀器移液器：0.25～2.5 μL；20～200 μL；100～1000 μL（Dragonlab TopPette Pipettor）。生物安全柜：BSC-1100ⅡB2-X（BIOBASE濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；微測序分析儀（Microseq RT-Cycler 436博奧生物科技有限公司）。臺式機(jī)電腦：與微測序分析儀連接并安裝Microseq分析軟件。

1.2 樣本選擇

1.2.1 回顧性研究隨機(jī)選取的63例血液標(biāo)本來源于北京小湯山醫(yī)院2012年1月～2013年7月體檢中心體檢人員，其中男37例，女26例，華法林服用劑量由受試者提供醫(yī)院。

1.2.2 前瞻性研究20例患者血液標(biāo)本，來源于北京小湯山醫(yī)院2012年1月～2013年6月住院計劃服用華法林的患者（房顫16例、心臟支架手術(shù)2例、腦梗死1例、髖關(guān)節(jié)置換1例），所有患者在服藥期間均無嚴(yán)重不良反應(yīng)，均簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 患者血液樣本的處理及核酸提取

臨床采集患者外周全血2～3 mL于EDTA抗凝管中：①血液樣本處理：將待檢血液標(biāo)本顛倒混勻數(shù)次；②預(yù)處理液（10×保存液）與滅菌水按1∶9比例稀釋到工作液（1×預(yù)處理液）濃度；③取1.5 mL離心管，加入1 mL預(yù)處理液（工作液），取150 μL待檢血液標(biāo)本加入離心管中，上下顛倒充分混勻后，室溫靜置5 min；④將離心管放入離心機(jī)中，配平后3000 r/min離心5 min；⑤離心完成后取出離心管，可以看到在離心管底部有白色小塊狀物，用槍頭吸去上清；⑥加入100 μL PHARM-GENE 01 SNP分析保存液，用移液槍小心徹底混勻，至白色塊狀物溶解消失，在室溫靜置30 min。溶液呈現(xiàn)出澄清透明狀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因檢測

取相應(yīng)的耀金分基因分析檢測試劑，標(biāo)注好對應(yīng)的患者編號，待試劑完全熔化后，取編號對應(yīng)處理好的患者血液樣本1.5 μL加入分析試劑液面以下，蓋好管蓋后，放入儀器并記錄對應(yīng)位置編號，關(guān)閉儀器上蓋。在電腦端運(yùn)行Microseq微測序程序，選擇標(biāo)本放置的管口及檢測位點(diǎn)后運(yùn)行檢測程序。待檢測完成后儀器在結(jié)果欄自動給出檢測結(jié)果的基因類型。

1.5 回顧性研究

1.5.1 回顧性研究中樣本的基因檢測使用微測序法對63例樣本的CYP2C9*3和VKORC1 1639基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測。

1.5.2 回顧性研究中樣本的華法林預(yù)測維持劑量的計算依據(jù)63例受試者提供的年齡、體重和身高等相關(guān)信息，與受試者華法林相關(guān)基因的檢測結(jié)果，帶入國際華法林藥物遺傳學(xué)協(xié)會（IWPC）公式[7]計算預(yù)測維持劑量：IWPC公式：Dose（mg/weekly）=[5.6044-0.2614（age in decades）+0.0087（height in cm）+0.0128（weight in kg）-0.8677（VK-GA）-1.6974（VK-AA）-0.9357（CYP2C9-AC）-2.3312（CYP2C9-CC）-0.1092（Asian race）]2。其中，age in decades：年齡權(quán)重：患者年齡的十位數(shù)上的數(shù)字（56歲取數(shù)字5帶入計算）；VK-GA：當(dāng)VKORC1 1639的基因分型為GA（CT）時，VK-GA=1帶入公式，否則按照VK-GA=0帶入公式；VK-AA、CYP2C9-AC、CYP2C9-CC數(shù)值的確定與VK-GA方法一致；Asian race：屬于亞洲人群的研究樣本取數(shù)值1帶入公式，非亞洲人群取0。

1.6 前瞻性研究

1.6.1 前瞻性研究中樣本的基因檢測使用微測序法對20例前瞻性研究樣本的CYP2C9*3和VKORC1 1639基因位點(diǎn)檢測。

1.6.2 華法林起始劑量的確定依據(jù)患者的基因分型初步確認(rèn)起始劑量，再結(jié)合患者的體重信息進(jìn)行調(diào)整。起始劑量大小的確定依據(jù)Inna等[8]在Blood上刊發(fā)的論文。見表1。

表1 依據(jù)基因分型的華法林建議起始劑量（mg）

1.6.3 前瞻性研究中華法林預(yù)測維持劑量的計算與回顧性研究的計算類似，將患者各個數(shù)據(jù)帶入“1.5.2”項(xiàng)下公式計算。

1.6.4 個體化給藥指導(dǎo)方法個體化給藥計劃：前瞻性研究中的20例患者，首先按建議的起始給藥劑量，連續(xù)給藥5 d后，改為預(yù)測的維持劑量給藥。同時每天監(jiān)測患者的INR值，并依據(jù)INR值調(diào)整劑量。當(dāng)INR值穩(wěn)定在2～3之間時，記錄實(shí)際的維持給藥劑量。實(shí)際操作中，初始和維持的預(yù)測建議劑量由實(shí)驗(yàn)者與患者主治醫(yī)生同時計算，相互核對，再由醫(yī)生依據(jù)患者的實(shí)際情況酌情調(diào)整后對患者給藥。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 12.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，行正態(tài)分布分析，采用t檢驗(yàn)，再進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 回顧性研究中預(yù)測維持劑量與實(shí)際維持劑量的相關(guān)性

通過對回顧性樣本CYP2C9*3和VKORC1 1639位點(diǎn)的基因分型檢測，并結(jié)合受試者的年齡、身高和體重等相關(guān)信息，帶入IWPC的公式[7]，計算63例受試者的預(yù)測維持劑量。將預(yù)測維持劑量與受試者的實(shí)際維持劑量進(jìn)行相關(guān)性分析。見圖1。

預(yù)測和實(shí)際維持劑量的相關(guān)性分析通過SPSS軟件計算，設(shè)置檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，兩組數(shù)據(jù)在此條件下均成正態(tài)分布，符合檢驗(yàn)條件。預(yù)測和實(shí)際維持劑量的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，經(jīng)過軟件計算得到?jīng)Q定系數(shù)R2=0.427，說明患者的年齡、身高、體重及基因檢測結(jié)果等因素可以解釋42.7%的給藥劑量差異，與以往研究相符。

2.2 前瞻性研究結(jié)果

2.2.1 基因分型情況用微測序法對20例患者樣本相關(guān)基因進(jìn)行快速的基因分型，其中CYP2C9*3 AA型基因共有18例，AC型2例；VKORC1 1639 AA型共有10例，GA型共有9例，GG型1例。

2.2.2 前瞻性病例的預(yù)測維持劑量和實(shí)際維持劑量的確定根據(jù)患者相關(guān)基因的檢測結(jié)果，按“1.6.2”項(xiàng)下方法確定患者的起始給藥劑量。由患者相關(guān)基因分型結(jié)果結(jié)合患者的的基本信息帶入IWPC公式計算華法林預(yù)測維持劑量。按照預(yù)測劑量給藥后，依據(jù)INR值來進(jìn)行調(diào)節(jié)，至達(dá)到穩(wěn)態(tài)，記錄實(shí)際維持劑量。將每位患者的預(yù)測劑量和實(shí)際劑量帶入SPSS軟件，繪制散點(diǎn)圖并計算相關(guān)性。見圖2。其中20例前瞻性病例研究初始劑量和預(yù)測維持劑量計算后，由臨床醫(yī)師結(jié)合患者的自身情況和藥物情況作出調(diào)整便于患者服用。由于醫(yī)院實(shí)際使用藥物為2.5 mg/片，患者服藥時自己將1片最多分成4份來服用，每份的劑量實(shí)際不等，但為方便計算按照平均分配計算，故實(shí)際使用劑量中存在多位數(shù)小數(shù)，1.875 mg表示3/4片，3.125 mg表示5/4片等來計算。預(yù)測和實(shí)際維持劑量兩組數(shù)據(jù)在P=0.05均呈現(xiàn)正態(tài)分布，符合檢測條件，Pearson相關(guān)檢測結(jié)果顯示，其相關(guān)系數(shù)r=0.710，與以往研究的結(jié)果基本相符。

2.2.3 預(yù)測劑量和實(shí)際劑量相符情況臨床上將連續(xù)超出INR值范圍作為調(diào)整華法令劑量的指標(biāo)，每次調(diào)整的范圍在5%～20%，同時實(shí)際用藥過程患者最小可調(diào)整劑量在1/4片。故本實(shí)驗(yàn)選擇實(shí)際維持劑量和建議維持劑量的差異≤20%或者差異絕對值＜1/4片認(rèn)定預(yù)測與實(shí)際相符。經(jīng)計算，在前瞻性研究中，預(yù)測劑量和實(shí)際劑量相符的有7例，占到總例數(shù)的35%。

3 討論

圖2 前瞻性病例的預(yù)測維持劑量和實(shí)際維持劑量的散點(diǎn)圖

傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)中，不同的患者在同一疾病治療時采用同一治療方案，使用相同的藥物和同樣的劑量，而藥物在人體的吸收、分布、代謝則有著巨大的個體差異，這也導(dǎo)致出現(xiàn)了不同的治療效果、毒副作用和不良反應(yīng)。影響這些作用的是個人之間的遺傳差異和外部環(huán)境。隨著人類基因組測序的完成和藥物基因組學(xué)的發(fā)展，建立在基因檢測基礎(chǔ)上的個體化醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)發(fā)展的新方向。依據(jù)基因檢測患者外部環(huán)境結(jié)果醫(yī)生可以“量體裁衣”式地對患者合理用藥，進(jìn)而提高療效和減少不良反應(yīng)的發(fā)生。近年來隨著華法林藥物基因組學(xué)的不斷發(fā)展，在很大程度上解釋了華法林的個體差異和種族差異，并且已經(jīng)將華法林劑量與遺傳變異相關(guān)性的研究成果成功應(yīng)用于臨床來指導(dǎo)臨床實(shí)踐[9-12]。

本文首先依靠快速的基因檢測方法回顧性研究了63例患者樣本的華法林相關(guān)基因型，并研究了結(jié)合患者基本情況推算了維持劑量，通過SPSS軟件研究了通過該公式計算的維持劑量和實(shí)際劑量的關(guān)系，并通過散點(diǎn)圖計算其趨勢曲線，得到二者的相關(guān)性達(dá)到了42.7%，該結(jié)果與近期國內(nèi)外研究結(jié)果類似[13-15]，說明本檢測方法在臨床快速基因檢測中具有很高的可操作性，并可通過公式計算推測劑量。

前瞻性的研究在對20例患者的CYP2C9*3和VKORC1 1639位點(diǎn)進(jìn)行快速分型，并結(jié)合患者年齡、身高、體重等信息，依據(jù)文獻(xiàn)[8-9]的公式及方法計算患者的建議初始劑量和預(yù)測維持劑量，并對預(yù)測劑量與實(shí)際劑量進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示二者相關(guān)系數(shù)r值甚至達(dá)到0.7以上，說明在僅考慮遺傳差異、年齡、身高、體重等因素的情況下可以解釋約50%的劑量差異。并且經(jīng)過相符比例的計算，約35%的患者按照建議劑量服藥后不需或只需1次調(diào)整劑量即可達(dá)到穩(wěn)定維持劑量，可以有效較少患者的痛苦，具有較高的指導(dǎo)用藥價值。

但是由于是前瞻性的指導(dǎo)臨床用藥研究，患者的主治醫(yī)生對于預(yù)測結(jié)果的接受程度有限，同時本著患者安全用藥為基礎(chǔ)的原則，在具體工作中，醫(yī)生往往以自己的經(jīng)驗(yàn)為主，輔助參考本研究的基因檢測結(jié)果和計算的劑量，在初始劑量方面都是按照2～3 mg的劑量來用藥，并沒有按照已有研究結(jié)果建議的劑量給藥，這主要是由于相關(guān)研究建議的劑量大大超出了醫(yī)生臨床經(jīng)驗(yàn)的劑量，如果冒然按照建議去使用可能存在風(fēng)險，然而這也進(jìn)一步反映了已有研究給出的劑量缺乏臨床基礎(chǔ)，提示還需要更切合臨床的參考計算標(biāo)準(zhǔn)。而在維持劑量的應(yīng)用上，更多的是給臨床醫(yī)生提示了患者可能的劑量范圍，增強(qiáng)了醫(yī)生給患者增減劑量的信心。本實(shí)驗(yàn)由于條件限制，前瞻性研究規(guī)模很小，患者多為老年人，且突變概率較高，尚需進(jìn)一步大樣本研究，以進(jìn)一步優(yōu)化本研究所述的基因檢測指導(dǎo)用藥方法，同時進(jìn)一步驗(yàn)證其臨床意義。

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The study of Warfarin doses based on related gene type

ZHANG HaoFENG Linlin
Beijing Xiaotangshan Hospital,Beijing102211,China

Objective To study the correlation between the actual Warfarin maintenance doses and the predicted doses calculated based on CYP2C9*3 and VKORC1 1639 genotyping results retrospective,and to study the prospective indiidualized dosing on the basis of the method.Methods Microseq genetic analysis method was used to detect Warfarinrelated gene types,Warfarin in patients with related gene types was detected,the predicted initial Warfarin dose and maintenance dose were calculated according to IWPC combined with the patients'age,height and weight.63 patients and 20 patient samples were carried out for retrospective and prospective study.Their doses were calculated using the formula,the correlation between the suggested doses and actual doses were analyzed using SPSS statistical software. Results Retrospective study results recommended the correlation between the suggested doses and the actual maintenance doses reached 42.7%.Further prospective studies showed that,approximately 35%of patients recommended maintenance dose basically consistent with the actual maintenance dose.Conclusion Such Warfarin dose calculations based on rapid genetic analysis has a high clinical value,and this method can be used to guide individual treatment of Warfarin.

Warfarin;VKORC1;CYP2C9*3

R965

B

1673-7210（2014）09（a）-0151-05

2014-05-04本文編輯：衛(wèi)軻）

馮琳琳，女，碩士，主任技師，北京小湯山醫(yī)院檢驗(yàn)科主任；研究方向：臨床檢驗(yàn)。