王志雄 高劍文 繆偉偉

1.上海理工大學(xué)，上海200093；2.上海醫(yī)療器械高等專科學(xué)校醫(yī)療器械工程系，上海200093

桑葉對腫瘤血管生成的影響

王志雄1，2高劍文1繆偉偉1，2

1.上海理工大學(xué)，上海200093；2.上海醫(yī)療器械高等?？茖W(xué)校醫(yī)療器械工程系，上海200093

目的研究桑葉對腫瘤血管生成中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成的影響。方法用CCK-8試劑盒測定HUVEC-2C細(xì)胞數(shù)量的變化；用Transwell轉(zhuǎn)移小室研究HUVEC-2C細(xì)胞遷移情況；用包被Matrigel的24孔板來培養(yǎng)HUVEC-2C細(xì)胞觀察其管腔形成情況。實驗分為實驗組和對照組，每組分別設(shè)置3個復(fù)孔，在實驗組中加入桑葉浸出液。觀察桑葉對腫瘤血管生成的影響。結(jié)果桑葉液可抑制HUVEC-2C細(xì)胞的增殖能力，抑制作用隨著濃度的增長而增強(qiáng)。在濃度為100、50、25 mg/mL時，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)濃度為100 mg/mL的桑葉液時細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)到37.6%。通過觀察Transwell小室，與對照組比較，添加了桑葉液的HUVEC-2C細(xì)胞，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實驗中，與未加入桑葉液的HUVEC-2C細(xì)胞所形成的較完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)比較，加入桑葉液的HUVEC-2C細(xì)胞在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。結(jié)論桑葉液通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，對腫瘤血管的生成具有抑制作用。

桑葉；腫瘤血管；內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；遷移；管腔形成

1971年，F(xiàn)olkman[1]首次提出血管生成與腫瘤生長之間的關(guān)系問題。隨后許多研究陸續(xù)證明，腫瘤形成初期，腫瘤細(xì)胞能夠通過彌散方式獲取營養(yǎng)物質(zhì)。但長到一定大小后，必須從最近的血管處誘導(dǎo)形成自身血管。如果沒有血管生成這一過程，腫瘤就會因得不到足夠的營養(yǎng)和氧氣而進(jìn)入休眠階段，甚至壞死[1]。血管為腫瘤生長提供營養(yǎng)和氧氣，也是其排泄的通道，更是轉(zhuǎn)移的必要條件[2]。這就為治療腫瘤提供了一個新思路——通過阻斷腫瘤血管的生長，切斷腫瘤營養(yǎng)與氧氣的供應(yīng)，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤血管與正常血管存在很大差異，但無論是腫瘤血管還是正常的血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell）都是血管的主要組成部分，襯貼于血管內(nèi)壁。

目前，市場上銷售的血管生成抑制藥物大都成本高昂，作用途徑比較單一，治療不夠徹底，副作用仍然較大，在實際應(yīng)用中存在一些問題。近年來，隨著人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，世界各地相關(guān)學(xué)者專家都在極力尋求天然、安全、保健性食品藥品的開發(fā)，這種回歸自然的愿望已成為走向21世紀(jì)的趨勢。探尋引起不良反應(yīng)小的植物成分藥已成為血管生成抑制劑發(fā)展的重要方向[3]。特別是低價易得植物材料，不但可以解決惡性腫瘤早期防治問題，同時也可充分降低治療成本，給更多癌癥患者提供更大的生存機(jī)會。

桑葉，作為古老的中藥，其味甘、性平、寒，具有清肝明目聰耳，鎮(zhèn)靜神經(jīng)，潤肺熱，止咳的作用。近年來，有關(guān)學(xué)者致力于對天然、安全、保健性藥食品的開發(fā)，通過對桑葉化學(xué)成分及生理功能的研究，發(fā)現(xiàn)其含有的黃酮類、生物堿等生物活性成分，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗炎、抗衰老等功效，還能預(yù)防腫瘤細(xì)胞的生成[4-8]，被國家衛(wèi)生和計劃生育委員會列為藥食兩用植物。特別是類黃酮中的槲皮素能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的分裂增殖，通過多種途徑促進(jìn)其凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲，降低其耐藥性等作用[9-13]。筆者從血管生成抑制方面來研究桑葉中有效成分對腫瘤生長的影響。

本課題通過探討低價易得植物材料桑葉中的有效成分對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及管腔形成的作用，來探索其對腫瘤血管生成的抑制作用，判斷桑葉有效成分抑制腫瘤血管生成的可行性，從而為腫瘤早期預(yù)防和治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

桑葉（日本株式會社黑姬和漢藥研究所）；HUVEC-2C（Cascade biologics公司，批號C-003-2C）；PBS（pH為7.4，實驗室配制）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Biowest公司提供）；細(xì)胞消化液（Trypsin0.25%-EDTA0.02%，Biowest公司提供）；胎牛血清（South America Origin，Biowest公司提供）；雙抗（青霉素-鏈霉素，碧云天生物研究所提供）；CCK-8（上海博谷公司）；Matrigel（威格拉斯生物公司提供）。

1.2 實驗設(shè)備

超凈工作臺（SW-CJ-1B，蘇州安泰）；電子天平（FA2104，上海舜宇恒平）；二氧化碳培養(yǎng)箱（CPST100A，長沙長錦科技）；超聲處理儀（JY92-ⅡDN，寧波新芝生物科技股份有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52CS，上海雅榮生公司）；酶標(biāo)儀（DNM-9602G北京普朗公司）；倒置生物顯微鏡（LWD200-37T，上海測維光電）等。鑷子；手套；無菌針管；0.22 μm針頭過濾器；2 mL PE試管；50 mL離心管；燒杯；量筒；雙蒸水；培養(yǎng)皿；離心管；25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning）；3 mL巴氏吸管（Corning）；Transwell轉(zhuǎn)移小室（Corning）；血球計數(shù)器。

1.3 方法

1.3.1 桑葉有效成分的提取[14-15]精確稱取桑葉粉3.00 g，浸泡于60 mL 75%的乙醇中。在50℃、20～25 kHz超聲頻率下超聲30 min后過濾，并將濾渣用60 mL 75%的乙醇再次超聲30 min。將得到的兩次濾液合并超聲混勻，再用0.45 μm的濾紙過濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在0.08 mPa、60℃的環(huán)境下蒸發(fā)2.5 h以去除乙醇，得到的溶液定容至30 mL。之后使用0.22 μm的一次性針頭過濾器過濾除菌，最終得到的桑葉液濃度為100 mg/mL，依次兩倍梯度稀釋至50、25、12.5 mg/mL。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)實驗中HUVEC-2C用配制好的DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%雙抗）進(jìn)行培養(yǎng)，用含0.25%胰蛋白酶（0.02%EDTA）消化傳代。二氧化碳培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為5%CO2，37℃。

1.3.3 增殖實驗取對數(shù)生長期HUVEC-2C，進(jìn)行消化、計數(shù)，控制細(xì)胞數(shù)量至5×104個/mL。在96孔板中設(shè)實驗組（100、50、25、12.5 mg/mL）、陽性對照組、陰性對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔，在實驗組和陽性對照組中分別加入每孔100 μL的細(xì)胞懸液，陰性對照組加入100 μL培養(yǎng)基。在96板內(nèi)培養(yǎng)HUVEC-2C 8 h直至細(xì)胞完全貼壁。在實驗組中分別加入10 μL不同濃度桑葉制備液（100、50、25、12.5 mg/mL），陽性對照組、陰性對照組加入10 μL無血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h之后將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞無異常生長情況，再在每孔中加入10 μL CCK-8檢測試劑，1 h后用酶標(biāo)儀在單波長450 nm處檢測OD值。OD值與細(xì)胞密度成正比，OD值越大說明細(xì)胞密度越大，反之則越小。

1.3.4 遷移實驗取對數(shù)生長期HUVEC-2C，進(jìn)行消化、重懸后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×106/mL。在Transwell轉(zhuǎn)移小室的上室每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加600 μL無血清DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)8 h后，在實驗組的下室加100 μL濃度為100 mg/mL的桑葉浸出液，對照組加100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔。將Transwell轉(zhuǎn)移小室置于5% CO2，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，用PBS清洗小室內(nèi)側(cè)，棉球擦去上室內(nèi)側(cè)中的細(xì)胞。小室外側(cè)細(xì)胞用無水酒精固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min。洗凈后置于倒置生物顯微鏡下觀察、拍照并分析。

1.3.5 管腔形成實驗用每孔100 μL的Matrigel包被24孔板，室溫下放置30 min使Matrigel凝固。取出對數(shù)生長期的HUVEC-2C，消化、重懸后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至5×105/mL。實驗組和對照組每孔接種500 μL細(xì)胞懸液。此外，對照組不加桑葉浸出液，實驗組加50 μL濃度為100 mg/mL的桑葉浸出液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將24孔板放入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h后置于倒置生物顯微鏡下觀察，隨機(jī)選3個視野拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中細(xì)胞增殖的抑制率（%）=1-實驗組/對照組×100%。

2 結(jié)果

2.1 桑葉有效成分對HUVECs的增殖影響

結(jié)果顯示，通過酶標(biāo)儀檢測實驗組（100、50、25、12.5 mg/mL）得到的OD值分別為（0.093±0.010）、（0.124± 0.005）、（0.132±0.002）、（0.144±0.002），而陽性對照組的OD值則為（0.149±0.007）。實驗組（100、50、25 mg/mL）顯著低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示桑葉液對HUVEC的增殖抑制作用顯著，且當(dāng)桑葉液濃度達(dá)到100 mg/mL時效果更為明顯（P＜0.01）。當(dāng)濃度為100 mg/mL的桑葉液時細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)到37.6%。

2.2 桑葉浸出液對HUVECs遷移的影響

如圖1所示，其中陰影部分為被染色的內(nèi)皮細(xì)胞，透明小圓圈是聚碳酸酯膜上的小孔?；罴?xì)胞可以通過小孔往下室遷移，遷移的內(nèi)皮細(xì)胞大部分貼于上室底面外側(cè)。本實驗對遷移至上室底面外側(cè)的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行固定染色，通過對比實驗組與對照組染色細(xì)胞數(shù)目的多少，判斷桑葉浸出液對細(xì)胞遷移作用影響。經(jīng)結(jié)晶紫染色后可以看出，實驗組遷移至上室底面細(xì)胞的密度小于對照組的細(xì)胞密度，即由于桑葉液的影響，內(nèi)皮細(xì)胞遷移至Transwell小室膜下的數(shù)量受到抑制。

2.3 桑葉液對HUVECs管腔形成的影響

如圖2所示，按照預(yù)期，對照組形成了典型的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，內(nèi)皮細(xì)胞之間排列有序，組成一個個環(huán)狀管腔結(jié)構(gòu)；而實驗組中則沒有形成完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，左下角似乎形成了半個環(huán)，但是內(nèi)皮細(xì)胞排列不似對照組那么緊密有序，且細(xì)胞形態(tài)不好，即受到桑葉液的影響，內(nèi)皮細(xì)胞未能在基質(zhì)膠模型上形成比較完整環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

圖1 桑葉液對內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC-2C遷移的影響

圖2 桑葉液對內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的影響

3 討論

正常環(huán)境下，血管生成是一個高度有序的過程，只有生長組織有所需求時，才會誘導(dǎo)單層靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞分化及血管網(wǎng)絡(luò)伸展。而腫瘤細(xì)胞可以通過模擬正常血管生成過程形成自身血供。腫瘤血管生成主要是通過分泌促血管生長因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖、遷移和形成管腔[16]。

桑葉液具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞系增殖的能力，抑制作用隨著濃度的增長而增強(qiáng)。通過觀察Transwell小室，與對照組相比添加了桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實驗中，與未加入桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系所形成的較完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)相比，加入桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。實驗表明，桑葉液通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，對腫瘤血管的生成具有抑制作用，從而為其制約腫瘤血管生成、切斷營養(yǎng)與氧氣供給和廢棄物排泄通道、促使腫瘤細(xì)胞凋亡提供有力佐證。本研究為桑葉在腫瘤早期預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，使腫瘤早期防治和低成本治療成為可能。

關(guān)于本研究只進(jìn)行了大量的定性實驗，得出桑葉具有抑制血管生成的功效，具體程度尚不明確，且桑葉中的有效組分未知，在之后的研究中將就以上兩個方面進(jìn)一步給予探討。

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Inhibitory effect of mulberry leaf on tumor angiogenesis

WANG Zhixiong1,2GAO Jianwen1MIAO Weiwei1,2
1.University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai200093,China;2.Medical Engineering Department, Shanghai Medical Instrumentation College,Shanghai200093,China

Objective To study the influence of mulberry on vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming in tumor angiogenesis.Methods The change of HUVEC-2C cell quantity was measured with CCK-8 kit;HUVEC-2C cell migration was studied in Transwell chamber;HUVEC-2C cells were cultured in a 24-pore plate coated with Matrigel to observe its lumen forming.The experiment consisted of experiment group and control group,with three complex holes set for each group.Mulberry leachate was added to the experiment group.The effect of mulberry leaf to tumor angiogenesis was observed.Results Mulberry leachate could inhibit the proliferation ability of HUVEC-2C cell,with the inhibiting effect strengthened as the concentration increases.When the concentration was 100,50,25 mg/mL,the difference between the experiment group and the control group had statistical significance(P＜0.05).When the concentration was 100 mg/mL,the cell proliferation inhibiting ratio of mulberry leachate could reach 37.6%.Observation on Transwell chamber showed the follows:added with mulberry leachate,the HUVEC-2C cells′migration ability was inhibited to some extent compared with the control group.In Matrigel experiment,compared with the comparatively complete cyclic structure formed by HUVEC-2C cells without mulberry leachate,the HUVEC-2C cells added with mulberry leachate were obviously inhibited in term of lumen forming.Conclusion Mulberry leachate has inhibiting effect on tumor angiogenesis by inhibiting vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming.

Mulberry leaf;Tumor angiogenesis;Endothelial cells;Proliferation;Migration;Lumen formation

R282.71

A

1673-7210（2014）09（a）-0022-04

2014-05-21本文編輯：衛(wèi)軻）