陸茂 葉俊儒 彭科 宋黎

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，四川成都610500

PI-103對人黑色素瘤A375細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其機(jī)制研究

陸茂 葉俊儒 彭科 宋黎

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科，四川成都610500

目的觀察PI-103在體外對人黑色素瘤A375細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并探討可能的作用機(jī)制。方法應(yīng)用MTT法檢測不同濃度PI-103對A375細(xì)胞增殖的影響，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測0.1、0.2 μmol/L PI-103對A375細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響，Western Blot法測定細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表達(dá)。結(jié)果0.1、0.2 μmol/L PI-103對A375細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯（P＞0.05）；在濃度高于0.4 μmol/L時，PI-103能夠明顯抑制A375細(xì)胞的增殖（P＜0.05）。0.1 μmol/L PI-103作用后，遷移實(shí)驗(yàn)和運(yùn)動實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（91.73±13.80）、（63.67±8.54），與對照組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.2 μmol/L PI-103作用后，遷移實(shí)驗(yàn)和運(yùn)動實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（64.07±9.22）、（34.80±7.89），與對照組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，A375細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)I-103可通過下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)抑制A375細(xì)胞遷移和侵襲，為其應(yīng)用于抗惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

PI-103；黑色素瘤；遷移；侵襲

惡性黑素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，易轉(zhuǎn)移是其死亡率高的主要原因。黑色素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活密切相關(guān)，在有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑中，篩選出高效、低毒的抗黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物已成為其研究重要的發(fā)展趨勢。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與其上游的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（PKB，又稱Akt）構(gòu)成了PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。筆者前期及既往其他研究結(jié)果顯示，PI3K/Akt/mTOR信號通路與黑素細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]。PI-103是PI3K和mTOR的雙重抑制劑，已有研究報(bào)道，PI-103在較低濃度下就能導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞周期阻滯，從而抑制其增殖并誘導(dǎo)凋亡[3]，但有關(guān)PI-103對黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響國內(nèi)外鮮見報(bào)道。本研究旨在觀察PI-103在體外對人黑色素瘤A375細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

PI-103（純度99.59%）購自美國MCE公司；人黑色素瘤A375細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Millicell懸掛式Transwell小室（孔徑8 μm）購自美國Millipore公司；Matrigel購自美國BD公司；鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）、MMP-9單抗、堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將A375細(xì)胞置于37℃、5%CO2的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%FBS的RPMI1640。每隔48 h換液1次，以1∶3的比例傳代。

1.2.2 MTT法檢測PI-103對A375細(xì)胞增殖的影響取對數(shù)生長期A375細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于48孔板，200 μL/孔。培養(yǎng)24 h后吸除培養(yǎng)液，每孔分別加入200 μL不同濃度的PI-103（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L），每組設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照組，對照組加入等量不含PI-103的培養(yǎng)液。24 h后加入20 μL MTT（5 mg/mL），37℃作用4 h后加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測490 nm處吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD/對照組OD）×100%。

1.2.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測PI-103對A375細(xì)胞遷移力的影響取對數(shù)生長期A375細(xì)胞以1× 105/mL細(xì)胞懸液接種于24孔板，24 h后加入不同濃度的PI-103（終濃度0.1、0.2 μmol/L），設(shè)空白對照組，對照組加入等量不含PI-103的培養(yǎng)液，48 h后收集細(xì)胞。各組細(xì)胞消化、離心后用無血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。將Transwell小室置入24孔板，上室加入200 μL無血清RPMI1640培養(yǎng)液，37℃放置1 h，吸除小室內(nèi)培養(yǎng)液，上室加入200 μL各組細(xì)胞重懸液，下室加500 μL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2孵育24 h后取出小室，棉簽擦去濾膜上層細(xì)胞，PBS清洗濾膜，4%的多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min。400倍顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)不重疊5個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測PI-103對A375細(xì)胞侵襲力的影響4℃溶解Matrigel過夜，用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)液以1∶8稀釋Matrigel，取50 μL均勻涂于Transwell小室上室的聚碳酸酯膜上，37℃放置30 min，使Matrigel聚合成凝膠，后續(xù)同遷移實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種密度為2×105/mL。

1.2.5 Western Blot法測定PI-103對A375細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響同“1.2.3”項(xiàng)下操作收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，離心提取蛋白質(zhì)定量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉，加入鼠抗人MMP-2、MMP-9單抗作一抗，4℃過夜，TBST洗膜，用堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL進(jìn)行曝光，洗片后用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，以GAPDH作為內(nèi)參，用各蛋白吸光度值/內(nèi)參吸光度值進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PI-103對A375細(xì)胞增殖的影響

0.1、0.2 μmol/L PI-103對A375細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯，與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在濃度高于0.4 μmol/L時，PI-103能夠明顯抑制A375細(xì)胞的增殖，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。為了排除PI-103抑制A375細(xì)胞增殖作用對遷移和侵襲的影響，本研究選擇低于0.4 μmol/L的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PI-103對A375細(xì)胞遷移力和侵襲力的影響

0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，與對照組比較，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 PI-103對A375細(xì)胞增殖的影響（x±s）

表2 PI-103對A375細(xì)胞遷移力和侵襲力的影響（x±s）

2.3 PI-103對A375細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

與對照組比較，0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后，A375細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 PI-103作用后A375細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)情況

表3PI-103對A375細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響（%，x±s）

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號通路在多種惡性腫瘤中高度激活，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、生長、轉(zhuǎn)移等過程，已成為腫瘤治療的一個重要靶點(diǎn)[4]。有研究表明，單純阻斷PI3K/Akt通路，并不能有效抑制下游mTOR通路，因?yàn)閙TOR信號通路的激活除了來自PI3K/Akt途徑，還可來自其他信號通路，而單純抑制mTOR通路，卻可能通過負(fù)反饋活化PI3K激酶。所以，同時使用PI3K和mTOR的雙重抑制劑更能有效抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[5]。PI-103是人工合成的脂質(zhì)激酶家族中的一種小分子藥物，能同時抑制PI3K和mTOR，尤其是PI3Kα、mTORC1和mTORC2，而且PI-103有良好的藥物穩(wěn)定性，毒副作用小[6-7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PI-103可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞[7]、乳腺癌細(xì)胞[8]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[9]、肝星狀細(xì)胞細(xì)胞[10]、腎癌細(xì)胞[11]的增殖，還可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞[12]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞[13]的轉(zhuǎn)移，同時可增強(qiáng)順鉑[6]、厄洛替尼[14]等化療藥物抗腫瘤效果。

Transwell小室能夠較為理想地模擬和反映腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，是檢測腫瘤細(xì)胞體外遷移力和侵襲力最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)旨在研究PI-103對A375細(xì)胞遷移和侵襲的影響，若出現(xiàn)細(xì)胞活力下降則影響結(jié)果的判斷，因此本研究選擇了PI-103對A375細(xì)胞活力影響小的濃度（低于0.4 μmol/L）來進(jìn)行Transwell體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，經(jīng)0.1、0.2 μmol/L PI-103作用后穿過小室的A375細(xì)胞數(shù)量減少，提示PI-103可以降低A375細(xì)胞的遷移力和侵襲力。

腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程，細(xì)胞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的降解突破是其中重要的環(huán)節(jié)之一。MMPs是基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白水解酶，其中MMP-2、MMP-9是MMPs家族中的重要成員，能有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原和層粘連蛋白，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。有研究表明，PI3K可通過活化Akt激活黑色素瘤細(xì)胞磷脂蛋白2，進(jìn)而促進(jìn)MMP-2的表達(dá)[16]。大量研究證實(shí)，黑色素瘤細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平與其侵襲力呈正相關(guān)，抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)能抑制黑素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17-18]。本研究顯示，PI-103在體外可抑制A375細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)，由此推測PI-103可能是通過競爭性抑制黑色素瘤細(xì)胞PI3K/mTOR，阻斷Pl3K/Akt/mTOR信號通路，下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制其遷移和侵襲。

綜上所述，PI3K/mTOR雙重抑制劑PI-103在體外可抑制A375細(xì)胞遷移和侵襲，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)，這顯示了它在惡性黑素瘤治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值，為其應(yīng)用于抗惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移治療提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of PI-103 on migratory and invasive abilities of human melanoma A375 cells and its mechanism

LU MaoYE JunruPENG KeSONG Li
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610500,China

Objective To investigate the effects of PI-103 on the migratory and invasive abilities of human melanoma A375 cells in vitro and its mechanism.Methods The effects of PI-103 with different concentration on the proliferation of A375 cells were detected by MTT assay.The effects of PI-103 at 0.1,0.2 μmol/L concentration on the migratory and invasive abilities of A375 cells were detected by transwell chamber assay.The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells were determined by Western Blot.Results The inhibition effects on the proliferation of A375 cells treated with PI-103 at 0.1,0.2 μmol/L concentration were not significant(P＞0.05).The proliferation of A375 cells treated with PI-103 at the concentration higher than 0.4 μmol/L was significantly inhibited(P＜0.05).The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.1 μmol/L concentration were (91.73±13.80),(63.67±8.54)respectively,which were significantly decreased compared with control group(P＜0.05). The numbers of transmembrane cells in the migration and invasion experiment treated with PI-103 at 0.2 μmol/L concentration were(64.07±9.22),(34.80±7.89)respectively,which were significantly decreased compared with control group(P＜0.05).The expressions of MMP-2 and MMP-9 in A375 cells treated with PI-103 at 0.1,0.2 μmol/L concentration were significantly decreased compared with control group(P＜0.05).Conclusion PI-103 can inhibit the migration and invasion of A375 cells by down-regulation of the expressions of MMP-2 and MMP-9,which provide the experimental basis for the prevention of melanoma metastasis.

PI-103;Melanoma;Migration;Invasion

R739.5

A

1673-7210（2014）09（a）-0014-04

2014-05-23本文編輯：程銘）

四川省衛(wèi)生廳立項(xiàng)科研課題（編號110466）。

陸茂（1975-），男，碩士，副主任醫(yī)師；研究方向：皮膚組織病理學(xué)。