阮浩瀾 陳琪 黎旸 孫清萍 陳素珍

廣東省食品藥品檢驗所藥理毒理室，廣東廣州510180

中藥注射液體外腎細胞毒性評價的方法學探討

阮浩瀾 陳琪 黎旸 孫清萍 陳素珍

廣東省食品藥品檢驗所藥理毒理室，廣東廣州510180

目的研究柴胡注射液和丹參注射液在犬腎近端小管上皮細胞（MDCK細胞）和人胚腎細胞（HEK-293細胞）模型的毒性作用，并探討中藥注射液體外腎細胞毒性檢測的實驗方法。方法選用馬兜鈴酸A作為陽性對照，將不同廠家和批次的丹參注射液、柴胡注射液的原液及稀釋液，與MDCK細胞或HEK-293細胞共同孵育，通過四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）量化細胞毒性，計算相對增殖率，進行中藥注射液體外腎細胞毒性評價。結果在MDCK細胞模型中，兩批丹參注射4個液稀釋濃度下毒性分級顯示為0級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為0級，柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為0級；在HEK-293細胞模型中，一批丹參注射液4個稀釋濃度下毒性分級顯示為1級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為1級，一批稀釋27、81倍后顯示為1級；柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為2級。結論利用腎臟細胞來源的細胞，可嘗試建立中藥注射液體外腎細胞毒性檢測的實驗方法。

中藥注射液；腎；細胞毒性；四甲基偶氮唑鹽比色法

中藥所致的腎臟損害在世界范圍內日益受到重視，目前顯示許多中藥具有腎毒性作用[1]，中藥腎毒性已經嚴重制約了中藥在臨床上的使用。中藥注射液大部分都是經血管給藥，其對腎臟損害的風險性更應提高警惕，如穿心蓮內酯注射液已發(fā)現(xiàn)可導致患者急性腎損害[2]。因此，建立一個快捷有效的中藥注射液腎毒性評價方法具有重要的意義。

目前體外細胞毒性試驗廣泛應用于生物材料、醫(yī)療器械和藥品包裝材料的毒性研究[3-5]，可以對受試物潛在的細胞毒性進行檢測。在中藥注射液方面，有研究選用小鼠成纖維細胞（L929細胞）進行體外細胞毒性的分析[6-7]，但用腎臟來源的細胞進行中藥注射液的腎毒性體外評價的研究少見報道。本研究選用來源于腎臟的犬腎近端小管上皮細胞（MDCK細胞）和人胚腎細胞（HEK-293細胞），參考中藥注射液在L929細胞毒性檢測的四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）[6]，考察中藥注射液對MDCK細胞和HEK-293細胞的體外細胞毒性作用，對建立基于MDCK細胞或HEK-293細胞的中藥注射液體外腎細胞毒性模型進行探討。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

柴胡注射液（廣東羅浮山國藥股份有限公司，批號L13C302），丹參注射液（廣東遠大藥業(yè)有限公司，批號130501、130502、130503）。馬兜鈴酸A（中國藥品生物制品檢定所，批號110746-200406）。馬兜鈴酸A用二甲基亞砜（DMSO，終濃度為0.5%）溶解，配成100 μmol/mL儲存液。實驗時，用DMEM培養(yǎng)液稀釋至實驗濃度。DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。胰酶（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）。乳酸脫氫酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）。其他試劑為國產分析純試劑。

1.2 儀器

電子天平（Sartorius，德國）；Eppendorf離心機。生物安全柜（Nuaire，美國）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；多功能酶標儀（Molecular Devices，美國）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)MDCK細胞和HEK-293細胞均購自中山大學實驗動物中心細胞庫。取對數(shù)生長期的MDCK細胞和HEK-293細胞用胰酶消化后制成細胞懸液，用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）以105個/mL的細胞濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板內，每孔100 μL。置37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 MTT法檢測馬兜鈴酸A對MDCK細胞和HEK-293細胞的抑制作用用DMEM培養(yǎng)液將馬兜鈴酸A分別配制成0.5、5、50、500 nmol/L四種不同的濃度（各自DMSO終濃度為0.5%）。96孔板內細胞分為對照組、馬兜鈴酸A四種不同濃度組，每組6孔。對照組更換含0.5%DMSO的DMEM培養(yǎng)液；馬兜鈴酸A各濃度組更換為含0.5、5、50、500 nmol/L馬兜鈴酸A的DMEM培養(yǎng)液。每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后進行MTT檢測。

1.3.3 中藥注射液稀釋及培養(yǎng)將中藥注射液用DMEM培養(yǎng)液按1∶3、1∶9、1∶27、1∶81進行稀釋，空白對照為DMEM培養(yǎng)液。將上述樣品液及對照液分別加入接種MDCK細胞或HEK-293細胞的96孔板內，每孔100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用MTT法進行檢測并計算細胞相對增殖率并對細胞毒性進行評價。

1.3.4 MTT法檢測中藥注射液對MDCK細胞和HEK-293細胞的細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）及細胞毒性評價RGR的計算公式：RGR（%）=(試驗組平均OD值)/(對照組平均OD值)× 100%；細胞毒性評價標準參考GB/T14233.2-2005細胞毒性試驗[8]。依據(jù)RGR對毒性反應分級，其中0級：RGR≥100%，為無毒性；1級：80%≤RGR＜100%，為極輕度毒性；2級：50%≤RGR＜80%，為輕微毒性；3級：30%≤RGR＜50%，為中度毒性；4級：0%≤RGR＜30%，為重度毒性。

1.3.5 MTT檢測方法參考相關文獻進行檢測[9]，細胞培養(yǎng)結束前4 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，混勻，用酶標儀測定光密度值（OD值），測定波長為490 nm。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。先進行方差齊性檢驗，各組方差齊用LSD進行統(tǒng)計，若方差不齊，用Tamhane's T2進行統(tǒng)計。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 馬兜鈴酸A對MDCK細胞和HEK-293細胞的抑制作用

當MDCK細胞給予0.5、5、50、500 nmol/L的馬兜鈴酸A孵育24 h后，OD值均出現(xiàn)下降。與對照組比較，50、500 nmol/L組的OD值明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。HEK-293細胞給予0.5、5、50、500 nmol/L的馬兜鈴酸A孵育24 h后，50、500 nmol/L組的OD值也明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明馬兜鈴酸A對MDCK細胞和HEK-293細胞增殖均具有明顯的抑制作用。見表1。

表1 MTT法檢測馬兜鈴酸A對MDCK細胞和HEK-293細胞增殖的影響

2.2 中藥注射液對MDCK細胞相對增殖率的影響

3個批次的丹參注射液和1個批次的柴胡注射液對MDCK相對增殖率的影響見表2。由表可見，2個批次（批號130501和130503）的丹參注射液4個稀釋濃度的細胞毒性分級均為0級。1個批次（批號130502）稀釋9、27、81倍后細胞毒性分級均為0級。柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為0級。

2.3 中藥注射液對HEK-293細胞相對增殖率的影響

3個批次的丹參注射液和1個批次的柴胡注射液與HEK-293孵育24后，毒性分級結果顯示，同一批丹參注射液（批號130502）4個稀釋濃度的細胞毒性分級均為1級，同一批（批號130501）稀釋9、27、81倍后顯示為1級，一批（批號130503）稀釋27、81倍后顯示為1級。柴胡注射液稀釋27倍后顯示為27、81級。見表3。

表2 不同中藥注射液對MDCK細胞相對增殖率的影響

表3 不同中藥注射液對HEK-293細胞相對增殖率的影響

3 討論

馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ是馬兜鈴酸的兩個主要成分[10]，其中馬兜鈴酸Ⅰ（又名馬兜鈴酸A）是馬兜鈴酸的主要毒性成分[11]，具有明顯的腎毒性作用[12]。有研究顯示馬兜鈴酸在體外可明顯抑制大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E細胞）增殖并誘導細胞凋亡[13]，MDCK細胞也是一種腎小管上皮細胞，常用于中藥成分的體外腎毒性評價研究[14-15]，故本實驗選用MDCK細胞作為中藥注射液體外腎毒性評價的細胞模型。實驗結果顯示，馬兜磷酸A均能夠顯著抑制MDCK細胞和HEK-293細胞的增長，可選用為該細胞模型的陽性對照藥。為了探討體外腎細胞毒性模型對不同批次和不同品種的中藥注射液的毒性反應，本研究選用了三批丹參注射液和一批柴胡注射液進行考察，參考GB/T14233.2-2005細胞毒性試驗對中藥注射液體外腎細胞的毒性反應進行分級。實驗結果顯示，在MDCK細胞模型中，兩批丹參注射液4個稀釋濃度下毒性分級顯示為0級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為0級，柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為0級；在HEK-293細胞模型中，一批丹參注射液4個稀釋濃度下毒性分級顯示為1級，一批稀釋9、27、81倍后顯示為1級，一批稀釋27、81倍后顯示為1級；柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為2級。中藥注射液諸多因素均可引起細胞毒性，如主要的中藥成分、pH值、滲透壓、藥品輔料等均可以引起細胞死亡。因此，本實驗不同批次和不同品種的中藥注射液之間毒性反應分級可能存在較大的差異。若建立起穩(wěn)定的體外細胞毒性模型，對同一品種的中藥注射液進行多批次的毒性檢測并進行毒性分級，綜合分析數(shù)據(jù)后或許可對中藥注射液的腎毒性安全性評價提供有意義的參考數(shù)據(jù)。

在本實驗中，不同種屬來源的MDCK細胞和HEK-293細胞對同一批次的中藥注射液的毒性顯示出不同的靈敏度，因此，建立中藥注射液體外腎細胞毒性模型還可以選用多種來源的腎細胞，如人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）等[16]，進行對比分析，或許最終能從諸多腎臟來源的細胞中建立起一個穩(wěn)定可靠的中藥注射液體外腎細胞毒性模型對中藥注射液的腎毒性進行安全性評價。

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Methodological evaluation of the renal cell toxicity of Chinese medicine injection

RUAN HaolanCHEN QiLI YangSUN QingpingCHEN Suzhen
Department of Pharmacology and Toxicology,Guangdong Institute for Food and Drug Control,Guangdong Province, Guangzhou510180,China

Objective To study the cytotoxicity of Salvia Injection and Bupleurum Injection in MDCK cells and HEK-293 cells and discuss the applicability of these experimental methods.Methods Aristolochic acid A was selected as a positive control drug.MDCK cells and HEK-293 cells were incubated with different concentrations of Salvia Injection or Bupleurum Injection.Then cytotoxicity was evaluated with MTT assay and relative growth rate(RGR)was calculated. Results In MDCK cell model,the RGR from two batches of Salvia Injection were shown as Class 0 after diluting 4 levels and one was shown as Class 0 after diluting 9,27,81 times.The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 0 after diluting 27,81 times.Meanwhile,in HEK-293 cell model,the RGR from one batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 4 levels.One batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 9,27,81 times.One was shown as Class 1 after diluting 27,81 times.The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 2 after diluting 27,81 times.Conclusion The use of kidney-derived cells can help to establish experimental methods to test the Chinese medicine injection nephrotoxicity.

Chinese medicine injection;Kidney;Cell toxicity;MTT assay

R285.1

A

1673-7210（2014）09（a）-0011-04

2014-05-19本文編輯：衛(wèi)軻）

廣東省建設中醫(yī)藥強省立項資助科研課題（編號20111153）。

阮浩瀾（1979-），男，廣東茂名人，博士；研究方向：藥品安全性與有效性評價。

陳琪，碩士，副主任藥師，從事藥品安全性與有效性評價工作。