唐 強(qiáng)，廖 琦，郝 亮，蔡 風(fēng)，彭源祥，劉春龍

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，江西南昌330006)

創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)炎是繼發(fā)于高能量關(guān)節(jié)創(chuàng)傷的骨性關(guān)節(jié)炎，即便目前有先進(jìn)的外科干預(yù)，仍有40%經(jīng)歷過(guò)嚴(yán)重關(guān)節(jié)創(chuàng)傷的患者最終發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎，其基因治療關(guān)注度越來(lái)越高。研究認(rèn)為T(mén)NF-α 是創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)炎性病理進(jìn)程中加重軟骨破壞和基質(zhì)降解最重要的炎性細(xì)胞因子之一［1］。

RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA 誘發(fā)的基因沉默，是高效阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的最有效方法。慢病毒載體感染效率高，能在傳代細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)靜止期細(xì)胞亦有較高轉(zhuǎn)染效果。目前利用RNAi 沉默TNF-α 表達(dá)的研究報(bào)道很少，本研究采用RNAi 方法，構(gòu)建針對(duì)兔TNF-α 的重組慢病毒，探討其抑制兔創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中TNF-α 基因的表達(dá)，進(jìn)而為創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)炎的的基因治療開(kāi)辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑:GV118 慢病毒3 質(zhì)粒載體系統(tǒng)(上海吉?jiǎng)P基因公司);Lipofectamine 2000 試劑和Trizol 試劑(Invitrogen公司);293T 細(xì)胞系和兔創(chuàng)傷后膝關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室原代獲取);Real-time PCR 試劑盒(Toyobo 公司，QPS201);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 公司);PRISM? 7500 Sequence Detection System(ABI 公司);培養(yǎng)基(Gibco 公司):DMEM-F12和胎牛血清(Hyclone 公司):20%;青鏈霉素(碧云天公司):1%無(wú)蛋白干細(xì)胞用凍存液(賽業(yè)生物科技公司)，細(xì)胞上清液TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒(BD 公司)。

1.2 方法:1)siRNA 的設(shè)計(jì)與合成siRNA 由銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成，序列如下:TNF-α-siRNA-A 靶序列5'-GCCTTCAGAACTCCATTCTCAGA-3'，正義鏈:5'-GCCUUCAG AACUCCAUUCUCAGAdTdT-3'，反義鏈:3'-dTdTCGGAAGUC UUGAGGUAAGAGUCU-5';TNF-α-siRNA-B 靶序列5'-TGGT GATTATTGATTATTTATTA-3'，正義鏈:5'-UGGUGAUUAUUG AUUAUUUAUUAdTdT-3'，反義鏈:3'-dTdTACCACUAAUAAC UAAUAAAUAAU-5';TNF-α-siRNA-C 靶序列5'-CACGTTTTC CGTGAAAACAGAGC-3'，正義鏈:5'-CACGUUUUCCGUGAAA ACAGAGCdTdT-3'，反義鏈:3'-dTdT GUGCAAAAGGCACUUU UGUCUCG-5'。2)細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞取自構(gòu)建的兔創(chuàng)傷后膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，獲取原代細(xì)胞后，使用多聚賴(lài)氨酸處理細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)表面，采用DMEM-F12 培養(yǎng)液(含20%胎牛血清和1%青-鏈霉素)，37 ℃、5% CO2恒溫孵育箱孵育，常規(guī)用0.25%胰蛋白酶消化傳代，用第3～6 代處于對(duì)數(shù)增殖期滑膜細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3)重組慢病毒構(gòu)建與包裝構(gòu)建如下反應(yīng)體系合成TNF-α-siRNA-A:10 ×緩沖液2 μL，上下游引物各0.4 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.8 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，模板1 μL，加入超純水補(bǔ)足20 μL，合成oligo片段，按GV118 慢病毒3 質(zhì)粒載體系統(tǒng)試劑盒說(shuō)明，將載體線性化后純化吸收，與上述合成的oligo 片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆后擴(kuò)增提取DNA 片段，線性化后利用Lipofectamine 2000 試劑轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝并進(jìn)行滴度測(cè)定。同理構(gòu)建并包裝另外兩組重組慢病毒。4)重組慢病毒感染滑膜細(xì)胞感染前1 天將滑膜細(xì)胞以1 ×105細(xì)胞/孔接種至12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～90%時(shí)進(jìn)行感染，結(jié)果分為4 組:NC(陰性對(duì)照)、siRNA-A、siRNA-B 和siRNA-C，將上述3 組實(shí)驗(yàn)病毒液同等劑量以最佳感染指數(shù)(MOI=20)感染對(duì)應(yīng)組滑膜細(xì)胞，NC 組加入等量蒸餾水。培養(yǎng)8～12 h 后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換新鮮完全培養(yǎng)基。置培養(yǎng)板于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。5)Real-time PCR檢測(cè)TNF-α mRNA 表達(dá)水平提取細(xì)胞總RNA:嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)使用TRizol 試劑裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA。按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所有操作在冰浴條件下進(jìn)行，20 μL 反應(yīng)體系徹底混合后，30 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，72 ℃孵育10 min，然后使用Real-time PCR 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)(方法依照使用說(shuō)明)。冰浴條件下操作，引物徹底混合后放入儀器:ABI PRISM? 7500 Sequence Detection System，使用軟件7500 software v2.0.6 分析，反應(yīng)程序如下:95 ℃1 min，95 ℃15 s，62 ℃30 s(收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)，60 ℃，所有反應(yīng)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔反應(yīng)，結(jié)束后確認(rèn)熒光定量PCR 的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，結(jié)果采用相對(duì)定量法分析，目的基因相對(duì)表達(dá)量利用2－ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。6)ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清液TNF-α 收集上述轉(zhuǎn)染48 h 后細(xì)胞上清液，按BD 公司TNF-α ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。使用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品按說(shuō)明書(shū)稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)樣品進(jìn)行3 復(fù)孔檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α-siRNA 重組慢病毒構(gòu)建與包裝:成功構(gòu)建3 組重組慢病毒，經(jīng)檢測(cè)序列與預(yù)期DNA 序列相符，說(shuō)明合成的TNF-α-siRNA 沉默序列插入正確，重組成功，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(測(cè)序經(jīng)由上海生工生物完成)。慢病毒感染293T 細(xì)胞72 h后熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)(圖1)，siRNA-A、siRNA-B 和siRNA-C 組病毒滴度分別為4.12 ×108、4.25 ×108和4.03×108TU/mL，均滿足慢病毒RNAi 后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 重組慢病毒感染293T 細(xì)胞72 h 后熒光分布Fig 1 Fluoresence distribution of recombinant lentivirus infected in 293T cells 72 hours postinfection(×100)

2.2 滑膜細(xì)胞TNF-α mRNA 表達(dá)水平:感染48 h 后，siRNAA 組與siRNA-C 組滑膜細(xì)胞TNF-α mRNA 表達(dá)較對(duì)照組均受到明顯抑制，分別減少55%和65%(P＜0.01)(表1)。

2.3 細(xì)胞上清液TNF-α 定量測(cè)定的結(jié)果:感染48 h 后，siRNA-A組與siRNA-C 組滑膜細(xì)胞上清液中TNF-α 表達(dá)較之對(duì)照組明顯減少(P＜0.01)(表1)。

表1 重組慢病毒感染后滑膜細(xì)胞分泌TNF-α及TNF-α mRNA 表達(dá)Table 1 The secretion of TNF-αand expression of TNF-α mRNA in synovial cells infected by recombinant lentivirus(±s，n=3)

表1 重組慢病毒感染后滑膜細(xì)胞分泌TNF-α及TNF-α mRNA 表達(dá)Table 1 The secretion of TNF-αand expression of TNF-α mRNA in synovial cells infected by recombinant lentivirus(±s，n=3)

＊P＜0.01 compared with control.

groupTNF-α(pg/mL)TNF-αmRNA control153.5 ±0.61.00 ±0.00 siRNA-A90.2 ±1.1*0.45 ±0.03*siRNA-B152.5 ±2.11.10 ±0.17 siRNA-C88.9 ±0.5*0.34 ±0.06*

3 討論

基因組學(xué)研究顯示，TNF-a 基因組區(qū)間與創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切［2］，在應(yīng)用動(dòng)物構(gòu)建的創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)模型中，發(fā)現(xiàn)早期關(guān)節(jié)滑液中幾乎全部可檢測(cè)出TNF-α，并且患側(cè)滑液中TNF-α 的含量高出健側(cè)數(shù)倍［3］。目前利用RNA 干擾阻斷TNF-a 表達(dá)進(jìn)而觀察對(duì)滑膜細(xì)胞作用效果的研究報(bào)道很少。

本研究利用慢病毒載體體內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定、安全性好的特點(diǎn)，在構(gòu)建兔創(chuàng)傷后骨性關(guān)節(jié)炎模型的基礎(chǔ)上，針對(duì)兔TNF-α基因序列成功設(shè)計(jì)并合成3 組siRNA，并進(jìn)一步合成了相應(yīng)重組慢病毒，將重組慢病毒感染滑膜細(xì)胞后測(cè)定滑膜細(xì)胞中TNF-α 基因的表達(dá)，顯示有2 組滑膜細(xì)胞TNF-α mRNA 表達(dá)明顯下降，同時(shí)細(xì)胞上清液中TNF-α 表達(dá)亦明顯受到抑制。雖然siRNA 最有效作用靶點(diǎn)仍有待進(jìn)一步研究，但本研究證實(shí)合理構(gòu)建的重組慢病毒感染滑膜細(xì)胞后能靶向抑制細(xì)胞TNF-α 的表達(dá)，為臨床以TNF-α 為靶點(diǎn)的創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)炎基因沉默治療提供了新的方向。

［1］Anderson DD，Chubinskaya S，Guilak F，et al.Post-traumatic osteoarthritis:Improved understanding and opportunities for early intervention［J］.J Orthop Res，2011，29:802-809.

［2］Loughlin J.The genetic epidemiology of human primary osteoarthritis:cuurent status［J］.Expert Rev Mol Med，2005，7:1-12

［3］Aizawa T，Kon T，Einhorn TA，et al.Induction of apoptosis in chondrocytes by tumor necrosis factor‐alpha［J］.J Orthop Res，2001，19:785-796.