曹玉凈，呂秋霞

(河南省中醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，河南鄭州450002

骨折愈合是一個(gè)極其復(fù)雜的修復(fù)過(guò)程，受諸多因素的影響，包括全身性因素和局部性因素。怎樣早期促進(jìn)骨折愈合，一直是骨傷科領(lǐng)域的重點(diǎn)課題之一。在骨折愈合的過(guò)程中，骨折部位的血液供應(yīng)、感染的影響、軟組織損傷程度、骨折端軟組織嵌入等都會(huì)影響愈合過(guò)程［1］。

肌糖蛋白C(tenascin－c，TN－C)，又被稱為神經(jīng)膠質(zhì)/間葉細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(GMEM)或肌腱抗原，是由分子質(zhì)量在190～300 ku 的亞基通過(guò)二硫鍵連接的寡聚物。與其他的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖連蛋白(fibronectin)和層粘連蛋白(laminin)相比，TN－C 的表達(dá)通常是瞬時(shí)的，并且高度控制在胚胎發(fā)育階段。但在正?；虿±淼慕M織重塑時(shí)，成體器官的特定組織重新表達(dá)TN－C。在組織損傷中，TN－C介導(dǎo)炎性反應(yīng)和纖維化進(jìn)程，促進(jìn)組織的再生修復(fù)［2］。近10年的研究發(fā)現(xiàn):TN－C 在心肌和動(dòng)脈損傷，腫瘤血管再生和腫瘤轉(zhuǎn)移，以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞的行為中有至關(guān)重要的作用［3，4］。但對(duì)于TN－C 是否能誘導(dǎo)骨再生尚缺乏相關(guān)的研究。本研究旨在探討TN－C 對(duì)骨再生的影響及潛在的機(jī)制，為T(mén)N－C 在促進(jìn)骨折愈合中的應(yīng)用提供可參考的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物科技公司);0.25%胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素(Hyclone 公司);堿性磷酸酶試劑盒(碧云天公司);BCA 蛋白定量試劑盒(Pierce 公司);骨鈣素放免試劑盒(Immutopics 公司);24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板和96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板板(上海生工生物科技有限公司);細(xì)胞茜素紅(上海杰美基因醫(yī)藥科技公司);cDNA 合成試劑盒、DMSO 和MTT(大連寶生物);鼠抗人TN－C 一抗及羊抗鼠二抗(Sigma 公司);RNAprep 總RNA 提取試劑盒和ECL 發(fā)光試劑盒(北京天根生物科技公司);重組人PDE1B(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與處理:所有材料的獲取按照標(biāo)準(zhǔn)流程在本實(shí)驗(yàn)室高級(jí)實(shí)驗(yàn)員的監(jiān)督下完成。本研究得到河南省中醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意。骨髓由2013年1月至6月于河南省中醫(yī)院住院患者志愿捐獻(xiàn)，所有患者均簽訂知情同意書(shū)。采用全骨髓培養(yǎng)法，多次消化以純化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)。分離純化的hBMSCs 培養(yǎng)在含有10% FBS，100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［5］。

1.2.2 重組TN－C 的制備:已有研究表明，骨肉瘤細(xì)胞MG－63 中TN－C 高表達(dá)［6］。因此本研究使用RNAiso 從人骨肉瘤細(xì)胞MG－63 中提取總RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取TN－C cDNA。以2 μL TN－C cDNA 作為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增TN－C。獲得的TN－C DNA 純化后插入pCDNA3.1(+)載體，并轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞人胚腎HEK293A 進(jìn)行TN－C 的體外表達(dá)。重組表達(dá)的TN－C 經(jīng)鎳柱親和層析純化并進(jìn)行Western blot 檢測(cè)其表達(dá)。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá):上述制備純化的rTN－C 經(jīng)BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白的濃度。取蛋白樣品30 μg，進(jìn)行SDS－PAGE 電泳。電泳結(jié)束后，通過(guò)電轉(zhuǎn)移將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后，將膜置于10 mL 現(xiàn)配的封閉液中2%脫脂奶粉，TBS(Tris－buffered saline，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris－HCl，pH 7.5)封閉1 h;依次加入鼠抗人TN－C 一抗(1∶1 000 稀釋)，4 ℃過(guò)夜孵育;TBST(TBS 含0.02% Tween)洗3 次，加入HRP偶聯(lián)的羊抗鼠二抗(1∶10 000 稀釋)室溫孵育2 h;TBST 洗膜3 次，TBS 洗膜1 次。使用ECL 發(fā)光試劑盒檢測(cè)TN－C 的表達(dá)。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:取生長(zhǎng)良好的hBMSCs 細(xì)胞制備細(xì)胞懸浮液，計(jì)數(shù)后以2 ×104個(gè)/孔接種于96 孔板，每孔200 μL。待細(xì)胞貼壁后，更換含有不同濃度重組TN－C 蛋白的條件培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)。12 h 后，向每孔加入5 g/L 的MTT 儲(chǔ)存液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄上清后，加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，置于低溫?fù)u床低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，并于酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm 處吸光度值(A)。

1.2.5 細(xì)胞茜素紅染色:原代培養(yǎng)8～11 d 后細(xì)胞匯合成單層，按1 ∶ 3 的比例傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以3 ×105個(gè)/孔接種到24 孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞匯合度基本達(dá)到50%，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行如下處理:實(shí)驗(yàn)組采用含有不同濃度重組TN－C(rTN－C)蛋白的條件培養(yǎng)液(0、1、10、50 和100 nmol/L)處理不同的時(shí)間，對(duì)照組采用不含TN－C 蛋白的完全培養(yǎng)液。不同處理的細(xì)胞培養(yǎng)一定的時(shí)間后，用細(xì)胞茜素紅對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，檢測(cè)hBMSCs 向成骨細(xì)胞的分化。

1.2.6 RT－qPCR 檢測(cè)ALP 和OCN mRNA 的表達(dá):收集實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M細(xì)胞，按照RNAprep 培養(yǎng)細(xì)胞總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以獲得的cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)ALP 和OCN 的mRNA水平變化，并以β－actin 作為內(nèi)參。本實(shí)驗(yàn)所使用的特異性引物序列如下:ALP:正義鏈:5'－GCACCATG ATTTCACCAT－3';反義鏈:5'－CTGGGCCCTCAGAAC AGGAC－3';OCN:正義鏈:5'－CGAGACACCATGAGA GCC－3';反義鏈:5'－GAGCGACACCCTAGACCG－3';β－actin:正義鏈:5'－CAACTTGATGTATGAAGGCTTT GGT－3';反義鏈:5'－ACTTTTATTGGTCTCAAGTCAGT GTACAG－3'。所有引物合成均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.7 ALP 比活性的測(cè)定:傳代的hBMSCs 細(xì)胞用含有不同濃度TN－C 重組蛋白的條件培養(yǎng)基以5 ×104/cm2接種于6 孔板中，在TN－C 重組蛋白作用的第3、6 和12 d 收集并裂解細(xì)胞，按照ALP 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并用BCA 蛋白定量試劑盒定量總蛋白。計(jì)算細(xì)胞內(nèi)ALP 比活性，單位為U/L。

1.2.8 OCN 含量的檢測(cè):傳代的hBMSCs 細(xì)胞用含有不同濃度rTN－C 的條件培養(yǎng)基以5 ×104/cm2接種于6 孔板中，在rTN－C 作用后按預(yù)計(jì)時(shí)間收集各組細(xì)胞，按骨鈣素放免試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)OCN含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)，并用Graphpad prism 5.0 作圖。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 重組TN-C 蛋白的檢測(cè)

鼠抗人TN－C 抗體能與重組TN－C 蛋白免疫，顯示單一的條帶，而對(duì)照組蛋白(本實(shí)驗(yàn)采用含有GST標(biāo)簽的重組人PDE1B)蛋白未能顯示條帶(圖1)。

2.2 rTN-C 促進(jìn)hBMSCs 向成骨細(xì)胞分化

不同濃度的rTN－C(0、1、10、50 和100 nmol/L)處理hBMSCs 24 h 后，細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯上升(圖2A)。在rTN－C 處理細(xì)胞的第10 天，rTN－C 劑量依賴性促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化(圖2B)。

圖1 Western blot 檢測(cè)制備的TN-C 重組蛋白Fig 1 Detection of recombinant TN-C by Western blot

圖2 rTN-C 對(duì)hBMSCs 增殖及礦化的影響Fig 2 The effect of rTN-C on the proliferation and mineralization of hBMSCs

2.3 rTN-C 對(duì)ALP 水平及比活性的影響

不同濃度rTN－C 處理hBMSCs 10 d 后ALP mRNA水平隨rTN－C 濃度顯著上升(P＜0.05)。但在rTN－C ＞50 nmol/L 后，ALP mRNA 水平與50 nmol/L組相比沒(méi)有顯著性變化(圖3 A)。

50 nmol/L rTN－C 處理hBMSCs 不同時(shí)間(3、6、9 和12 d)后，細(xì)胞內(nèi)ALP 的比活性明顯高于對(duì)照組(表1)，并隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而繼續(xù)顯著增高(P＜0.05)。

2.4 rTN-C 對(duì)OCN 的影響

與ALP 類(lèi)似，與對(duì)照組相比不同濃度rTN－C 處理hBMSCs 10 d 后，OCN mRNA 水平隨rTN－C 濃度

顯著上升。但rTN－C ＞50 nmol/L 時(shí)，OCN mRNA 水平與50 nmol/L 組相比沒(méi)有顯著性變化(圖3B)。50 nmol/L rTN－C 處理hBMSCs 后，OCN 含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，從處理后第12 d 起實(shí)驗(yàn)組OCN 含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)(表2)。

3 討論

TN－C 是細(xì)胞外基質(zhì)重要成分，最早發(fā)現(xiàn)其能調(diào)節(jié)細(xì)胞與纖連素之間的黏附，能被分類(lèi)為抗黏附和黏附調(diào)節(jié)蛋白。TN－C 在發(fā)育階段和成人中都能調(diào)節(jié)表達(dá)。組織學(xué)中觀察到TN－C 在器官形成中短暫表達(dá)，而在已經(jīng)完全發(fā)育成熟的器官中則豐度降低或者不表達(dá)。但是在一些病理情況下如感染，炎癥和腫瘤情況下表達(dá)升高。研究表明TN－C 在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移和生長(zhǎng)，影響腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、血管形成以及免疫抑制中有重要作用，另外TN－C 還參與炎癥反應(yīng)與組織重塑。骨折愈合過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜而連續(xù)的過(guò)程，主要包括幾個(gè)階段:血腫炎癥機(jī)化期、原始骨痂形成期、骨板形成塑形期。患者的年齡、健康狀況、骨折的類(lèi)型和數(shù)量、骨折部位的血液供應(yīng)、軟組織的損傷程度、軟組織的嵌入和感染等都是影響骨折愈合的重要因素。

鑒于TN－C 在組織重塑、血管再生和炎癥中的重要作用，本研究對(duì)TN－C 在骨折愈合中的潛在作用進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)rTN－C 能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，表現(xiàn)為增加骨基質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶含量和骨鈣素含量。

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)rT-C 處理細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)ALP 和OCN mRNA 水平變化的影響Fig 3 RT-PCR were employed to detect the mRNA level of ALP and OCN in cells treated with rT-C

表1 rTN-C 處理的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞ALP 活性測(cè)定Table 1 The activity of ALP in control group and experimental group treated with rTN-C(±s，U/L，n=3)

表1 rTN-C 處理的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞ALP 活性測(cè)定Table 1 The activity of ALP in control group and experimental group treated with rTN-C(±s，U/L，n=3)

＊P＜0.05 compared with control.

group culture time 3 days6 days9 days12 days control0.179 ±0.0250.210 ±0.0350.224 ±0.043 0.260 ±0.091 experimental0.362 ±0.033*0.561 ±0.022*0.570 ±0.018*0.705 ±0.113*

表2 不同時(shí)間OCN 含量的變化Table 2 The content of OCN in cells treated for different time (±s，ng/mL，n=3)

表2 不同時(shí)間OCN 含量的變化Table 2 The content of OCN in cells treated for different time (±s，ng/mL，n=3)

＊P＜0.05 compared with control.

group culture time 3 days9 days12 days18 days control0.321 ±0.0640.476 ±0.0610.601 ±0.052 0.790 ±0.091 experimental0.410 ±0.0390.590 ±0.0760.677 ±0.064*0.875 ±0.077*

ALP 是成骨細(xì)胞礦化過(guò)程中主要的功能活性酶，測(cè)定成骨細(xì)胞內(nèi)ALP 活性變化可反應(yīng)成骨細(xì)胞的分化成熟程度和細(xì)胞成骨礦化的能力，因此其常作為成骨細(xì)胞分化和功能成熟的早期標(biāo)志分子。ALP 主要存在于胞質(zhì)中，分解有機(jī)質(zhì)中磷酸，增加局部無(wú)機(jī)磷酸濃度，促進(jìn)礦化，在成骨細(xì)胞趨向成熟的轉(zhuǎn)化限制點(diǎn)扮演重要角色。本研究中發(fā)現(xiàn)，重組TN－C 蛋白處理人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞一定時(shí)間后，ALP 活性較未做任何處理的對(duì)照組顯著上升。

OCN 在維持正常骨鈣化率和抑制軟骨鈣化中有重要作用，也常用作成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在重組TN－C 處理細(xì)胞后的第12天開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組OCN 含量與未做處理的對(duì)照組相比差異升高。重組TN－C 對(duì)ALP 和OCN 的活性的影響說(shuō)明其對(duì)hBMCs 分化有促進(jìn)作用。結(jié)合重組TN－C 在組織重塑及血管再生中的重要作用，TN－C可能在骨折愈合中有促進(jìn)血管再生和促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟的雙重作用。

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