嚴(yán)玉蘭，賈麗娟，，劉 洋，張 金，張 杰，梁 冰，步雪峰

(江蘇大學(xué)1.附屬人民醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212002;2.臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)，江蘇鎮(zhèn)江212013;3.附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江212002)

肺癌被認(rèn)為是目前對人類健康及生命威脅最大的惡性腫瘤，是當(dāng)今世界各國常見的惡性腫瘤之一，據(jù)2012年美國癌癥研究中心統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)顯示，在新發(fā)的各種腫瘤中，肺癌的發(fā)病率在14%左右，位居第2 位［1］。長期以來，盡管積極采用各種治療方法包括化療、放療及手術(shù)等，肺癌患者的5年生存率仍然不足15%［2］。

目前，各國學(xué)者致力于研究一種集基因治療、免疫治療于一體的新的生物治療方法，即溶瘤治療。新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)的抗腫瘤作用已經(jīng)運(yùn)用于臨床實(shí)驗(yàn)研究，如急性單核細(xì)胞白血病、膠質(zhì)瘤、人卵巢癌、骨肉瘤、乳腺癌及結(jié)腸癌等，均顯示有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長作用［3-4］。其在肺癌研究國內(nèi)外尚少。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞A549(本實(shí)驗(yàn)保存);SPF 級、4周齡、體質(zhì)量18～22 g 裸鼠［揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證:SCXK(蘇)2012-0004］;表達(dá)狂犬病毒糖蛋白的重組新城疫病毒(recombinant avirulent NDV LaSota strain expressing the rabies virus glycoprotein，rl-RVG)與NDV 以及雞抗NDV一抗(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈);DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清(維森特公司);引物(上海捷瑞生物技術(shù)公司合成);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas);PCR 試劑盒(北京康維世紀(jì)有限公司);TUNEL 原位檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);小鼠抗狂犬病毒G 蛋白一抗(Santa 公司)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(北京康維世紀(jì)有限公司)，兔抗雞二抗(EARTHOX 公司)，兔抗caspase-3，8，9，Bax 和Bcl-2 一抗(博士德公司)。

1.2 荷瘤鼠的建立

取裸鼠30 只，人肺腺癌細(xì)胞A549 復(fù)蘇后移入含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖至指數(shù)增長期，胰蛋白酶消化后用PBS 平衡鹽液配制成5 ×108/mL 濃度的肺癌細(xì)胞懸液。給每只小鼠腋下皮下注射0.3 mL 細(xì)胞懸液，經(jīng)10 d 左右，每只小鼠皮下均長出直徑為5～20 mm 的瘤體。

1.3 分組實(shí)驗(yàn)

待荷瘤鼠皮下腫瘤長至5～20 mm 進(jìn)行感染研究，將皮下成瘤的裸鼠平均分為3 組，每組10 只，隨機(jī)分為rl-RVG 組、NDV 組及PBS 組。rl-RVG 組皮下瘤體注射rl-RVG 6 ×108pfu(空斑形成單位)，NDV 組注射NDV 6 ×108pfu，PBS 組瘤體注射PBS液200 μL，每周2 次，持續(xù)3 周。自第一次注射日起0、7、14 和21 d 游標(biāo)卡尺分別測量皮下腫瘤短徑(a)及長經(jīng)(b)(包括皮膚厚度在內(nèi))，根據(jù)公式V=a2×b ×0.52 計(jì)算瘤體體積，根據(jù)末次測量腫瘤體積計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(對照組平均腫瘤體積－處理組平均腫瘤體積)/對照組平均腫瘤體積×100%。21 d 時(shí)處死全部小鼠，鈍性剝離皮下腫瘤，部分組織4%多聚甲醛固定，部分組織－80 ℃保存待用。

1.4 RT-PCR 檢測RVG 及NDV HN 基因表達(dá)

取小鼠新鮮皮下瘤體，Trizol 法提取瘤體組織總RNA，以O(shè)ligo dT 為反轉(zhuǎn)錄引物用Fermentas 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板，引物分別為:RVG:上游5'-AGCCGATGCACTACAAG-3'，下游5'-CTGGA GGAGGGATGATTGC-3'，擴(kuò)增長度:175 bp;NDV HN:上游5'-CTGGACGGTTTGGTGGGAA-3'，下游5'-TAATGCGACTGCGGGATGTG-3'，擴(kuò)增長度:462 bp，進(jìn)行PCR，PCR 的循環(huán)條件:94 ℃熱啟動預(yù)變性5 min，94 ℃30 s，53 ℃ 30 s(NDV HN 為55 ℃30 s)，72 ℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L 瓊脂糖電泳分析。

1.5 凋亡檢測

取小鼠的部分皮下瘤體組織，4%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片。用TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡。按試劑盒的說明書操作，蘇木素復(fù)染，倒置顯微鏡下觀察分析。其中細(xì)胞核為棕色的為陽性細(xì)胞，在200 ×視野下選擇陽性細(xì)胞分布均勻的區(qū)域，連續(xù)計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，并計(jì)數(shù)其中陽性細(xì)胞，重復(fù)3次。凋亡指數(shù)(AD = 凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+未凋亡細(xì)胞數(shù))×100%)。

1.6 蛋白印跡法檢測caspase 系列及Bax/Bcl-2

取小鼠新鮮皮下瘤體組織，提取組織蛋白后，行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后分別使用兔抗caspase-3，8，9，Bax 和Bcl-2 為一抗，稀釋比為1∶500，山羊抗兔IgGHRP 為二抗，稀釋比為1∶10 000，行蛋白質(zhì)印跡檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3 周時(shí)各組荷瘤裸鼠腫瘤生長狀況

rl-RVG 感染后21 d 時(shí)rl-RVG 組和NDV 組腫瘤體積明顯小于對照組，且rl-RVG 組瘤體生長較NDV 組慢(P＜0.05)。rl-RVG 的抑瘤率為54.5%，NDV 的抑瘤率為37.5%(圖1，2)。

圖1 3 周時(shí)各組荷瘤裸鼠腫瘤生長狀況Fig 1 Status of tumor growth of experimenting group and control group at third week

2.2 RT-PCR 檢測RVG 及NDV HN 基因表達(dá)

3 組均可在496 bp 出現(xiàn)GAPDH 基因條帶(圖3A);rl-RVG 組在175 bp 出現(xiàn)RVG 基因條帶，NDV 組及PBS 組均無條帶(圖3B);rl-RVG 組及NDV 組在462 bp出現(xiàn)NDV HN 基因條帶，PBS 組無條帶(圖3C)。

圖2 3 周各組荷瘤裸鼠腫瘤瘤體積Fig 2 Tumor volume of experimenting group and control group in there weeks(±s，n=10)

2.3 腫瘤組織的細(xì)胞凋亡情況

rl-RVG 組及NDV 組凋亡細(xì)胞明顯高于PBS組，且rl-RVG 較及NDV 組凋亡細(xì)胞較多(P＜0.05)(圖4，表1)。

表1 rl-RVG 感染A549 荷瘤鼠后腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)Table 1 The apoptosis index of tumor infected with rl-RVG(±s，n=10)

表1 rl-RVG 感染A549 荷瘤鼠后腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)Table 1 The apoptosis index of tumor infected with rl-RVG(±s，n=10)

＊P＜0.05 compared with PBS;△P＜0.05 compared with rl-RVG.

groupAI PBS0.034 ±0.028 NDV0.211 ±0.038＊△rl-RVG0.302 ±0.052*

圖3 RVG 及NDV HN 基因表達(dá)Fig 3 Expression of RVG and NDV HN gene in the tumor tissues

圖4 rl-RVG 感染A549 荷瘤鼠后腫瘤細(xì)胞的凋亡Fig 4 The apoptosis of tumor infected with rl-RVG (×200)

2.4 Western blot 測caspase 系列及Bax/Bcl-2 比值

組織蛋白中表達(dá)的caspase-3，8，9 顯示，rl-RVG組及NDV 組表達(dá)較PBS 組明顯增多(P＜0.05)，rl-RVG較NDV 組表達(dá)增多(P＜0.05);rl-RVG 組及NDV 組Bax 表達(dá)高于PBS 組，而rl-RVG 組及NDV組Bcl-2 表達(dá)低于PBS 組，rl-RVG 組及NDV 組的Bax/ Bcl-2 吸光度比明顯高于PBS 組(P＜0.05)，且rl-RVG高于NDV 組(P＜0.05)(圖5，表2)。

圖5 Caspase3，8，9，Bax 和Bcl-2 的表達(dá)Fig 5 The expression of caspase-3，8，9，Bax and Bcl-2

表2 Caspase-3，8，9 和Bax/Bcl-2 的吸光度比值Table 2 The absorbance ratio of caspase-3，8，9 and Bax / Bcl-2(±s，n=10)

表2 Caspase-3，8，9 和Bax/Bcl-2 的吸光度比值Table 2 The absorbance ratio of caspase-3，8，9 and Bax / Bcl-2(±s，n=10)

＊P＜0.05 compared with PBS;△P＜0.05 compared with rl-RVG.

groupcaspase-3caspase-8caspase-9Bax/Bcl-2 PBS0.46 ±0.110.36 ±0.130.46 ±0.110.46 ±0.15 NDV0.92 ±0.19＊△0.80 ±0.22＊△0.78 ±0.19＊△0.92 ±0.24＊△rl-RVG1.40 ±0.31*1.22 ±0.19*1.24 ±0.29*1.40 ±0.29*

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤，中國肺癌的發(fā)病率一直呈上升趨勢。溶瘤治療是一種新的生物治療方法，很多種病毒具有溶瘤作用，例如單純皰疹病毒1 型，腺病毒等［5］，NDV 是最常用的，被認(rèn)為是一個(gè)很有潛力的溶瘤病毒。NDV 對腫瘤細(xì)胞具有選擇性地復(fù)制，并摧毀腫瘤細(xì)胞，同時(shí)保留正常的細(xì)胞，由此可以運(yùn)用于抗腫瘤的治療中［6-7］。其在肺癌研究國內(nèi)外尚少。NDV 對于人和動物來說也是一個(gè)很有前途的疫苗載體，通過對NDV 進(jìn)行重組，更有效的作用于腫瘤細(xì)胞［8-9］。

新城疫病毒的直接溶瘤作用主要是通過誘導(dǎo)凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的，誘導(dǎo)凋亡途徑的主要是激活內(nèi)在的和外在的凋亡通路及激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路［10］。NDV 感染腫瘤細(xì)胞后引起腫瘤細(xì)胞分泌TNF-α 和TRAIL 激活caspase-8，也可引起腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C 釋放，引起半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的次序激活，并激活caspase-9，NDV 凋亡途徑的激活可能是激活線粒體通路及caspase-9，以及后來激活的caspase-8 引起的［11］。

狂犬病毒的基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA［12］，從3'到5'的方向有5 個(gè)結(jié)構(gòu)基因［13］。其中狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)在誘導(dǎo)狂犬病毒的凋亡中起著非常重要的作用。減毒的狂犬病毒ERA 株糖蛋白的表達(dá)可以觸發(fā)人細(xì)胞發(fā)生涉及caspase-3，8 和9 的活化的細(xì)胞凋亡。

成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)狂犬病毒糖蛋白的重組新城疫病毒疫苗(rl-RVG)，RVG 的表達(dá)使NDV 在細(xì)胞之間的擴(kuò)散能力增強(qiáng)，使得rl-RVG 更有效的作用于腫瘤細(xì)胞;而RVG 的表達(dá)不會增強(qiáng)NDV 對老鼠及禽類的毒性［14］。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈的rl-RVG 感染人肺腺癌細(xì)胞A549 荷瘤鼠，研究其體內(nèi)抑制作用及部分機(jī)制，結(jié)果顯示:組織Tunel 實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞明顯增多，表明rl-RVG 可以使腫瘤細(xì)胞凋亡增加;檢測caspase-3，8，9 的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示rl-RVG 組及NDV 組caspase-3，8，9 表達(dá)量明顯高于PBS 組，表明rl-RVG 及NDV 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑之一是活化了 caspase-8，caspase-9 和caspase-3 蛋白信號通路;檢測rl-RVG及NDV 組Bax 蛋白及Bax/Bcl-2 比值明顯較PBS組的高，表明通過上調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)，Bax/Bcl-2比值增高，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是rl-RVG 及NDV 導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的途徑之一。

綜上所述:本實(shí)驗(yàn)明確了重組新城疫病毒rl-RVG 對肺腺癌的荷瘤鼠的腫瘤生長有著明顯的抑制作用，其可能機(jī)制與rl-RVG 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系，為進(jìn)一步研究rl-RVG 在肺癌方面的作用奠定了基礎(chǔ)。

志謝:感謝葛金英及步志高所在的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈與的重組新城疫病毒rl-RVG 與NDV 及技術(shù)支持，感謝錢海及陶燕博士給與的技術(shù)指導(dǎo)。

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