王 晶，賀 勇，張繼旺，廖 娟，曾家偉，周定安*

(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院1.檢驗科;2.中心實驗室，重慶402160;3.都江堰市人民醫(yī)院檢驗科，都江堰611830)

SAM and SH3 domain containing 1(SASH1)基因是一種新的候選抑癌基因，在多種組織中表達，其表達減少與腫瘤的生長、入侵、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)。但其在腫瘤形成、增殖和轉(zhuǎn)移中的作用機制并不清楚。

細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)信號傳導途徑是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信號通路中最重要的途徑之一，不僅可以調(diào)節(jié)細胞生長、分裂、增殖和遷移等多種生理功能，在細胞惡性轉(zhuǎn)化等病理過程中也起重要作用［1］。MAP4K4 是MAPK 信號系統(tǒng)的上游激酶，在細胞系中能夠調(diào)節(jié)ERK 活性的一種絲/蘇氨酸的蛋白激酶［2］。還有研究表明，MAP4K4 可激活MEK 和MEKK［3］。因此，本研究擬探討SASH1 與ERK 信號通路的兩個關(guān)鍵分子MAP2K2(mitogen activated protein kinase kinase 2)和MAP4K4 之間是否存在相互作用關(guān)系，為深一步研究SASH1 是否通過ERK 信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等細胞功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體:大腸桿菌E.coli Top 10(康為世紀生物有限公司)，pBABE-Flag-puro 反轉(zhuǎn)錄病毒、野生型 SASH1-Pegfp-C3 質(zhì)粒、MDA-MB-231 和HEK-293T 細胞(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院中心實驗室保存)。

1.1.2 試劑:限制性內(nèi)切酶(Hind Ⅱ、KpnⅠ、XhoⅠ和HpaⅠ)和DNA T4 連接酶(TaKaRa 公司)、哺乳動物蛋白抽提試劑LY006、SBP-beads(GE 公司)、Phusion Hot Start High Fidelity Polymerase (New England Biolabs 公司)。si-RNA 設(shè)計合成(上海吉瑪有限公司完成)，引物合成和測序(上海英駿生物公司廣州分公司完成)。

1.2 方法

1.2.1 SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重組質(zhì)粒的構(gòu)建:對SBP-Flag-pBABE-puro 反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒多克隆位點區(qū)進行改造，合成一對含有EcoR Ⅰ、SalⅠ、XhoⅠ和HpaⅠ酶切位點的互補引物，序列如下:5'-AATTCCCGCTCGAGCGGGTTAACATGG-3' (正 義鏈)，5'-TCGACCATGTTAACCCGCTCGAGCGGG-3'(反義鏈)。將該互補序列連接到SBP-Flag-pBABEpuro 反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，使其含有XhoⅠ和HpaⅠ酶切位點序列。用XhoⅠ和HpaⅠ從SASH1-Pegfp-C3質(zhì)粒上切下SASH1 基因并插入SBP-Flag-pBABEpuro 反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，通過菌落PCR 和測序鑒定SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重組質(zhì)粒。

1.2.2 建立穩(wěn)定表達外源性SASH1 基因的HEK-293T 細胞:將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Top 10 感受態(tài)細胞中，提取重組質(zhì)粒后用Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細胞，48 h 后加入2 ×10－3g/L 嘌呤霉素篩選細胞系，大量培養(yǎng)穩(wěn)定表達外源性SASH1 基因的細胞系(穩(wěn)定表達SASH1 基因的293T 細胞系簡稱SASH1-293T 細胞)。

1.2.3 Western blot 鑒定重組質(zhì)粒的表達:用蛋白抽提試劑LY006 提取SASH1-293T 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞蛋白，蛋白定量后加入上樣緩沖液，95 ℃煮沸使蛋白充分變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉，加PBS 稀釋的抗Flag 抗體(1∶400)。孵育過夜，TBST 洗膜后加羊抗鼠IgG(H +L)二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜后顯色。

1.2.4 SBP-pull down 實驗:待SASH1-293T 細胞長滿約90%時，用裂解液裂解15 min，將裂解產(chǎn)物在4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，收集上清。在裂解的蛋白質(zhì)樣品中加入60 μL SBP-beads(GE 公司)，4 ℃低速旋轉(zhuǎn)結(jié)合4 h 后3 000 r/min，低溫離心5 min，吸去上清。PBS 洗滌3 遍后留約1 mL 含沉淀復合物的懸液轉(zhuǎn)至1.5 mL 低蛋白親和離心管(eppendprf 公司的Protein LoBind Tube)中，一部分做Western blot 檢測Flag-SASH1 的表達情況，另一部分加50 mmol/L NH4HCO3，4 ℃，3 000 r/min 離心1 min，重復兩次，去掉上清。再加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3，用測序級胰蛋白酶在37 ℃旋轉(zhuǎn)儀上酶切過夜后，收集上清繼續(xù)用胰蛋白酶酶切8 h，取出兩次酶切蛋白生成的多肽，99 ℃滅活胰蛋白酶5 min，－20 ℃凍干，送復旦大學生物醫(yī)學研究院系統(tǒng)生物研究所做LC-MS/MS 串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.5 Nano-flow LC-MS/MS 質(zhì)譜分析:用兩臺LC-20AD 和一臺LC-20AB 色譜泵，一臺SIL-20AC 自動進樣器，樣品以20 μL/min 的速度注入loop 環(huán)中，使ACN 在120 min 內(nèi)由0%線性增加至45%，用LTQ-Orbitrap 線性離子阱-軌道離子阱質(zhì)譜儀以O(shè)rbitrap軌道離子阱(在400～2 000 的質(zhì)荷比范圍內(nèi)以60 000 的分辨率)采集一級質(zhì)譜圖，用LTQ 線性離子阱將以上采集得到的質(zhì)譜圖中強度最高的10 個信號進行串聯(lián)質(zhì)譜實驗。質(zhì)譜條件為:納升級電噴霧電離方式(nano-ESI)，正離子模式掃描，電離電壓1 900 V，離子入口管溫度180 ℃，掃描質(zhì)荷比范圍為400～2 000。質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Xcalibur 軟件采集并處理。處理后的數(shù)據(jù)用Bioworks 軟件根據(jù)Sequest 算法在SWISSPROT HOMO SAPIENS 數(shù)據(jù)庫及其對應(yīng)的反序列符合數(shù)據(jù)庫進行搜索。利用蛋白質(zhì)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/uniprot)和KEGG pathway 信號通路研究數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.p/dbget-bin/show _ pathway?hsa04916 +5605)分析可能與SASH1 結(jié)合的并參與ERK 信號通路調(diào)節(jié)的分子。

1.2.6 免疫沉淀檢測SASH1 與MAP2K2 和MAP4K4的相互作用:為進一步鑒定SASH1 與MAP2K2 和MAP4K4 是否存在相互作用，用pEGFP-C3 質(zhì)粒和SASH1-pEGFP-C3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞，然后提取蛋白進行免疫沉淀實驗。具體步驟:將細胞用冰的PBS 洗滌1 遍后蛋白裂解液裂解10 min。將裂解物在4 ℃，5 000 r/min，離心10 min，取上清。加入瓊脂糖蛋白A/G 后4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻45 min，4 ℃，5 000 r/min 離心5 min，取上清。再加入GFP-Tag(Abmart 公司)，4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻過夜后加20 μL proteinA/G Agarose，繼續(xù)4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻4 h。PBS 洗滌4 次，免疫沉淀物加上樣緩沖液煮沸變性、SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、分別加抗GFP-SASH1、MAP2K2、MAP4K4 一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入抗兔/鼠IgG，檢測其是否存在相互作用。

1.2.7 siRNA 細胞系的建立及檢測:將SASH1-siRNA 轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231 細胞系，以空白組和Negativ-siRNA 組為對照。siRNA 序列分別為:siRNA-1:5'-GCACGUUCAAGUUCAUCUATT-3'(正義鏈)，5'-UAGAUGAACUUGAACGUGCTT-3'(反義鏈);siRNA-2:5'-GACUCAGGAUGCUACGAAATT-3' (正義鏈)5'-UUUCGUAGCAUCCUGAGUCTT-3'(反義鏈);陰性對照組(NC):5'-UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3'(正義鏈)，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA TT-3'(反義鏈)。72 h 后用蛋白抽提試劑LY006 提取細胞蛋白，Western blot 檢測SASH1 和P-ERK1/2蛋白的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重組質(zhì)粒

擴增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小相符(圖1)。測序結(jié)果無雜峰和套峰，堿基無突變。SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重組質(zhì)粒中SASH1 與NCBI 公布的序列完全一致。因此SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 SASH1 基因PCR 鑒定結(jié)果Fig 1 PCR identification result for SASH1 gene

2.2 Flag-SASH1 融合蛋白在HEK-293T 細胞穩(wěn)定表達

SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro 重組質(zhì)粒組細胞在180 ku 附近表達Flag-SASH1 融合蛋白條帶，而空載質(zhì)粒無Flag-SASH1 融合蛋白表達(圖2)。

圖2 Flag-SASH1 融合蛋白的鑒定Fig 2 Identification of Flag-SASH1 recombinant protein

2.3 SBP-pull down 實驗和Western blot 實驗獲得SASH1 及與其結(jié)合蛋白

在180 ku 處看到過表達的Flag-SASH1 蛋白(圖3)。

圖3 SBP-pull down 實驗和Western blot 實驗證實SASH1 蛋白復合物中有Flag-SASH1 的表達Fig 3 SASH1 protein complex expression of Flag-SASH1 confirmed by SBP-pull down and western blot

2.4 SASH1 相互作用蛋白的質(zhì)譜鑒定

SASH1 本身的評分很高(200.3)，總共有37 條SASH1 蛋白的肽段，其中20 條為SASH1 的特異性肽段(表1，2，圖4)。圖3 中僅列出SASH1 蛋白的部分質(zhì)譜圖。分析發(fā)現(xiàn)與SASH1 結(jié)合的分子中，MAP2K2 和MAP4K4 參與ERK 信號通路的調(diào)節(jié)。而且，質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析顯示:MAP2K2 和MAP4K4 的評分也比較高(10.2 和20.3)，MAP4K4 鑒定到2 條肽段，其中1 條為特異肽段。MAP2K2 鑒定到1 條肽段。KEGG pathway database 顯示:1) MAP2K2(MEK2)在細胞中定位于 MAPK 信號通路;2)MAP4K4通過MEKK1 間接激活MAP2K2。因此，SASH1 可能與MAP4K4 和MAP2K2 直接或者間接結(jié)合，進而調(diào)節(jié)ERK 信號通路。

表1 LC-MS/MS 鑒定出的與SASH1 有互相作用的蛋白信息Table 1 Information about SASH1 binding proteins identified by LC-MS/MS analyses

表2 LC-MS/MS 串聯(lián)質(zhì)譜分析SASH1 蛋白復合物的肽段Table 2 The peptides of SASH1 protein complexes by LC-MS/MS mass

圖4 LC-MS/MS 質(zhì)譜鑒定SASH1、MAP2K2 和MAP4K4 蛋白質(zhì)譜圖Fig 4 SASH1，MAP2K2 and MAP4K4 protein spectrum identified by LC-MS/MS mass spectrum

2.5 免疫沉淀證實SASH1 與MAP2K2 和MAP4K4具有相互作用

在171 ku 處看到MAP4K4 的條帶，在50 ku 處看到 MAP2K2 的條帶，SASH1 與 MAP2K2 和MAP4K4 均結(jié)合。表明 SASH1 在細胞中與MAP2K2 和MAP4K4 均存在相互作用(圖5)。

2.6 SASH1 的表達抑制調(diào)節(jié)ERK1/2 的磷酸化水平

SASH1-siRNA 組SASH1 蛋白較空白和NegativsiRNA 對照組明顯減少(P＜0.05)(圖6)，表明RNA 干擾成功(圖6)。SASH1-siRNA 組P-ERK1/2蛋白表達與空白和Negativ-siRNA 對照組相比明顯增加。P-ERK1/2 相對含量也表明SASH1-siRNA 組P-ERK1/2 含量增加。提示SASH1 的表達抑制能夠增強ERK1/2 的磷酸化水平(圖7)。

圖5 免疫沉淀證實與SASH1、MAP2K2 和MAP4K4 結(jié)合Fig 5 Immunoprecipitation confirmed that SASH1 binded with MAP2K2 and MAP4K4

圖6 siRNA 干擾后SASH1 的表達和相對含量Fig 6 The expression of SASH1 and relative content knockdown by two pairs of siRNA

3 討論

SASH1 是SLY 家族成員的一種信號調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，具有SH3 and SAM 結(jié)構(gòu)域，在這些蛋白與蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)域中，這些結(jié)構(gòu)域使SASH1 在蛋白質(zhì)信號傳導級聯(lián)可能有重要作用［4］。該基因可在多種組織中表達，其表達減少與腫瘤的生長，入侵，轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)。多項研究發(fā)現(xiàn)SASH1 在乳腺癌、肺癌、胃癌等表達下調(diào)或缺失［5］。研究結(jié)腸癌和人腦膠質(zhì)瘤U251 細胞發(fā)現(xiàn)，在有侵襲和轉(zhuǎn)移腫瘤中SASH1 表達顯著下調(diào)，其表達減少與腫瘤的侵潤性生長和轉(zhuǎn)移的形成等相關(guān)［7-8］。骨肉瘤組織的SASH1 表達率明顯低于正常骨組織，且有肺轉(zhuǎn)移者的癌組織中表達率顯著低于無轉(zhuǎn)移者，也提示SASH1 的缺失或抑制在腫瘤的發(fā)生，侵潤和骨肉瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用［4］。然而SASH1 在腫瘤細胞中的增殖和轉(zhuǎn)移等的確切機制不是完全清楚。

圖7 SASH1-siRNA 組phospho-ERK1/2 的表達Fig 7 the expression of phospho-ERK1/2 in group of SASH1-siRNA

MAPK 信號通路中的Ras/Raf/MEK/ERK 通路可被多種刺激活化，調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育、分裂和凋亡等多種生理反應(yīng)過程，若持續(xù)活化可促進細胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及細胞增殖、遷移和侵襲等密切相關(guān)［9］。最近發(fā)現(xiàn)SASH1 作為TLR4 信號通路的復雜下游組件可激活早期內(nèi)皮反應(yīng)受體［10］。MAP2K2 和MAP4K4 廣泛分布于各組織中，可被多種細胞外信號激活，活化后可參與細胞凋亡、分化、增殖和惡性轉(zhuǎn)化等多種生物學功能。其在人類許多類型癌癥和癌細胞系中過表達，其中約有一半的胰腺導管腺癌組織與正常組織相比呈過表達現(xiàn)象［11-12］。本實驗質(zhì)譜結(jié)果提示，MAP4K4通過MEKK1 間接激活MAP2K2。MAP4K4 很可能通過Rac1-MEKK1-MAP4K4-JNK 途徑影響受體信號，在細胞的遷移和入侵中發(fā)揮重要作用［13］。MAP4K4 激酶的活性對Ras 誘導的轉(zhuǎn)化起重要作用，而Ras 可激活MEK/ERK 途徑發(fā)揮作用。因此，推測SASH1 是否通過ERK 信號傳導途徑調(diào)節(jié)細胞增殖及遷移等多種細胞功能的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示SASH1 與ERK 信號通路的重要分子MAP2K2 和MAP4K4 存在蛋白-蛋白相互作用，而且SASH1 的表達抑制能夠增強ERK1/2 的磷酸化水平。提示SASH1 可能通過與MAP2K2 和MAP4K4 直接或間接的結(jié)合參與ERK 信號通路，對其進行調(diào)節(jié)并存在新的“串話”，進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等細胞過程的發(fā)生，但它們相互作用的具體機制還需更進一步深入研究，為腫瘤的發(fā)生機制提供新的理論基礎(chǔ)和治療靶點。

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