瞿岱彪，邵 斌，袁志峰，王 芳，余 佳，劉會(huì)文*

(1.景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院骨科，江西景德鎮(zhèn)333000;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005)

MicroRNA(miRNA)是新近發(fā)現(xiàn)的在轉(zhuǎn)錄后水平起調(diào)控作用的一類非編碼RNA 分子［1］。一般而言，miRNA 是通過(guò)調(diào)控其靶基因，并可與轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳因子等共同調(diào)節(jié)各種復(fù)雜生命的活動(dòng)。有研究表明:Let-7 直接調(diào)控除RAS 之外的多種細(xì)胞周期蛋白，并直接抑制肺癌細(xì)胞增殖通路［2］，而在直腸癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Let-7a 后，明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖［3］。說(shuō)明Let-7 家族在腫瘤細(xì)胞惡性表型中起重要的調(diào)控作用。然而，越來(lái)越多的報(bào)道證實(shí)miRNA 在Ewing 肉瘤的發(fā)展中起重要的作用［4］。因此，探索Let-7a 在Ewing 肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況及其靶基因具有非常重要的意義，可為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

寡核苷酸Let-7a 成熟體(Let-7a_mimic)及其對(duì)照(Scramble 和mimic_control)(上海吉碼公司);Triol、細(xì)胞培養(yǎng)基(McCoy'5A)和胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)(Invitrogen 公司);青霉素及鏈霉素、丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨(AP)和SDS(Sigma 公司);轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT 1(Thermo 公司);胎牛血清(HyClone公司);單克隆抗體CDK6(EPITOMICS 公司);限制性內(nèi)切酶(Spe Ⅰ、Mlu Ⅰ和Kpn Ⅰ)(NEW ENGLAND 公司);Hybond-N 尼龍膜(Amersham 公司);PCR 反應(yīng)體系hs primer start(Takara 公司);SK-ES-1 細(xì)胞系(美國(guó)模式菌種收集中心)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);X 線片(柯達(dá)公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

SK-ES-1 細(xì)胞培養(yǎng)條件為:37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下分別用含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基McCoy'5A 培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前1 天，以合適濃度傳代，使SK-ES-1 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前處于對(duì)數(shù)增殖期。轉(zhuǎn)染前1 h，用無(wú)血清無(wú)雙抗的培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，按5 ×105/孔接種于6 孔板中，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);將Let-7a-PC/CDK6_WT/CDK6_MUT 與Let-7a mimic/mimic control 和pRL-TK 用DharmaFECT 1 共轉(zhuǎn)染SK-ES-1 細(xì)胞，具體步驟按照DharmaFECT 1 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

SK-ES-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Let-7a scramble，mimic，mimic control，具體轉(zhuǎn)染方法同上。

1.3 基因的構(gòu)建

根據(jù)Genebank 中CDK6 野生型的部分基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物引入Spe Ⅰ酶切位點(diǎn)(斜體加粗部分)，下游引物引入Mlu Ⅰ酶切位點(diǎn)(斜體加粗部分)，以人類基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。按照分子克隆的具體步驟，與通過(guò)Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切的pMIR-Reporter 載體進(jìn)行連接，構(gòu)建成CDK6_WT 質(zhì)粒。CDK6_MUT 是根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物，以CDK6_WT DNA 為模板，采用20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)反應(yīng)(98 ℃40 s，55 ℃40 s，72 ℃7 min)，最后72 ℃延伸10 min 后收集產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，并利用DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。CDK6_MUT 突變的引物長(zhǎng)度包含有45個(gè)堿基對(duì)，其中含有Let-7a 結(jié)合的突變位點(diǎn)-acgga，上下游引物通過(guò)DNAssit 軟件反向互補(bǔ)。最后采用限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ于37 ℃消化PCR 擴(kuò)增的模板4 h 所得。

用于陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒是根據(jù)Let-7a 成熟序列，設(shè)計(jì)含有Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位點(diǎn)的堿基序列，通過(guò)自身互補(bǔ)、退火，并通過(guò)Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位點(diǎn)構(gòu)建到pMIR-Reporter 載體上。所有構(gòu)建的載體均經(jīng)DNA 測(cè)序證實(shí)。上述引物序列(表1)。

1.4 Northern blot

使用Trizol 提取不同Ewing 肉瘤細(xì)胞系和MSCs 的總RNA。使用去離子甲酰胺在55 ℃下進(jìn)行30 min變性。每泳道30 μg 加入到15%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，后電轉(zhuǎn)移到Hybond-N 尼龍膜，晾干后進(jìn)行紫外膠聯(lián)，最后置于－80 ℃下進(jìn)行保存。合成與成熟miRNA Let-7a 序列互補(bǔ)的寡核苷酸并用做于探針，隨后γ-32P-末端標(biāo)記的miRNA探針加入到管中，并溫育。在雜交之后，將膜按照標(biāo)準(zhǔn)程序洗滌，用濾紙吸干水滴后用保鮮膜封好，－80 ℃下進(jìn)行放射自顯影，U6 snRNA 用作內(nèi)參。并以目的RNA/內(nèi)參照的灰度值來(lái)表示結(jié)果。

1.5 Let-7a 的real time PCR

提取轉(zhuǎn)染后的SK-ES-1 細(xì)胞，使用Trizol 提取細(xì)胞中的總RNA，具體操作按照Trizol 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總RNA 測(cè)定濃度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 第一鏈的合成。所用特異性反轉(zhuǎn)錄引物:內(nèi)參U6 RT 引物及Let-7a RT 引物參照表2，具體方法按照M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行兩步法擴(kuò)增檢測(cè)Let-7a的表達(dá)效率，相對(duì)定量值采用CT 計(jì)算［5］，并以U6 snRNA 作為相對(duì)定量的內(nèi)參，引物序列(表2)。

1.6 雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

通過(guò)Targetscan 靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站，分析了Let-7a可能的靶基因，然后將預(yù)測(cè)的靶基因CDK-6 mRNA的3'UTR 區(qū)包含Let-7a 結(jié)合位點(diǎn)的序列以及突變了結(jié)合位點(diǎn)的序列插入到螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告載體pMIR-reporterTMLuciferase 的下游，得到質(zhì)粒CDK6_WT 和CDK6-Mut，按照上述方法共轉(zhuǎn)染SKES-1 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活力，海腎熒光素酶(PRL-TK)作為內(nèi)參，測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性。此操作按照雙熒光分析系統(tǒng)進(jìn)行。

1.7 Western blot

收取轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，每泳道加入30 μg 處理的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h 后加入兔抗人一抗(anti-CDK6 1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，室溫下加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)孵育2 h。TBST 洗膜3 次，每次10 min后，暗室中顯影，蒸餾水終止反應(yīng)，GAPDH 為內(nèi)參。并以目的蛋白/內(nèi)參照的灰度值來(lái)表示結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Let-7a 在Ewing 肉瘤細(xì)胞系中系低表達(dá)

與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(MSCs)相比，在A673、RDES 和SK-ES-1 3 個(gè)細(xì)胞系中，Let-7a 的表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)(圖1)。

表1 分子克隆的引物序列Table 1 Primers sequence for cloning

表2 Real-time PCR 引物序列Table 2 Primer sequences for real-time PCR

圖1 在不同的細(xì)胞系中Let-7a 表達(dá)量變化Fig 1 Expression of Let-7a in different cell lines

圖2 質(zhì)粒pMiR-report-CDK6 的構(gòu)建與鑒定Fig 2 Identification of pMiR-report-CDK6

2.2 構(gòu)建pMIR-reporter-CDK6 3'非編碼區(qū)(3'UTR)野生型質(zhì)粒

電泳顯示在788 bp 處見(jiàn)一明顯擴(kuò)增條帶(圖2A);然后PCR 產(chǎn)物經(jīng)Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切后，電泳結(jié)果第4 泳道可見(jiàn)分別為6 440 bp 載體片段和788 bp 大小片段(圖2B)。DNA 測(cè)序證實(shí)目的基因序列與GeneBank 中的序列完全一致。

2.3 在SK-ES-1 細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Let-7a

在SK-ES-1 細(xì)胞系中Let-7a 的表達(dá)水平顯著升高(圖3)。其中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了50%～60%(P＜0.01)。

2.4 Let-7a 靶向抑制CDK-6 的表達(dá)

圖3 SK-ES-1 細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同的處理后Let-7a相對(duì)表達(dá)量Fig 3 The relative expression of Let-7a in different treatment of SK-ES-1

通過(guò)序列分析，于CDK6 mRNA 的3'UTR 有Let-7a 結(jié)合位點(diǎn)(圖4A);野生型CDK6(CDK6_WT)熒光素酶表達(dá)水平與對(duì)照組相比降低了約40%，(P＜0.05)通過(guò)采取“突變”實(shí)驗(yàn)，突變型(CDK6_MUT)熒光素酶表達(dá)水平與對(duì)照組相比降低了約15%(圖4B);在SK-ES-1 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Let-7a 后，抑制了CDK6 的蛋白的表達(dá)水平(圖4C)。

圖4 Let-7a 靶向抑制CDK6 表達(dá)Fig 4 Identification of CDK6 as a direct target gene of Let-7a

3 討論

越來(lái)越多的報(bào)道［6-7］miRNA 是在諸多的惡性腫瘤調(diào)控中起重要作用的一類非編碼RNA 分子。上調(diào)或者下調(diào)miRNA 將會(huì)影響腫瘤血管生成和腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。Let-7 家族作為一個(gè)抑癌miRNA 在許多惡性腫瘤中都是低表達(dá)的。該實(shí)驗(yàn)Northern blot 證實(shí)了與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞相比，Let-7a 在Ewing肉瘤中的表達(dá)量是明顯下調(diào)的。在Ewing 肉瘤中，融合蛋白EWS-FLI-1 直接結(jié)合到Let-7a 啟動(dòng)子，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而減少Let-7a 的表達(dá)，這是通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因HMGA2 而影響Ewing 肉瘤家族腫瘤的變化［8］。諸多報(bào)道證明CDK6 在惡性腫瘤和干細(xì)胞中是一種新興的增殖和分化的調(diào)節(jié)器［9-10］。該實(shí)驗(yàn)以SK-ES-1 細(xì)胞作為Ewing 肉瘤的體外模型，尋找Let-7a 潛在的靶基因。通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)網(wǎng)站(Target Scan，PicTar，miRanda)發(fā)現(xiàn)與遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖相關(guān)的基因超過(guò)1 000 個(gè)。Let-7a 作為抑癌miRNA 對(duì)Ewing 肉瘤最可能是通過(guò)調(diào)控CDK6而起作用的。CDK6 是細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶家族的成員，在細(xì)胞周期的調(diào)控中起到非常重要的作用。細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)順序調(diào)控細(xì)胞周期的正常表達(dá)，并且細(xì)胞周期蛋白激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)，其中一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的磷酸化是細(xì)胞周期進(jìn)程所必需的靶蛋白［11］。有報(bào)道證實(shí)CDK6 不但在細(xì)胞增殖中起非常重要的作用，而且阻礙細(xì)胞的分化［12］。這與其他的細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶不同，例如:CDK2和CDK4［13-14］。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了野生型質(zhì)粒(CDK6_WT)及其突變體(CDK6_MUT)和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒(Let-7a_PC)，并經(jīng)DNA 測(cè)序證實(shí)目的基因序列與DNA 序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列完全一致。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組熒光素酶表達(dá)水平相比，CDK6_WT 和CDK6_MUT 分別降低了約40%和15%，這表明Let-7a 與CDK6 3'UTR 存在結(jié)合位點(diǎn)。然后利用體外合成的寡核苷酸轉(zhuǎn)染SK-ES-1 細(xì)胞系，通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)成功過(guò)表達(dá)了Let-7a，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了50% －60%。采取Western blot 結(jié)果顯示抑制了CDK6 的蛋白的表達(dá)水平。因此，CDK6 是Let-7a 靶基因。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息軟件分析、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blot 確定了抑癌microRNA(Let-7a)在Ewing 肉瘤細(xì)胞系中靶基因，其可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期編碼蛋白CDK6 在Ewing肉瘤的惡性表型中發(fā)揮重要作用。這就為后續(xù)研究CDK6 的功能和Let-7a 在Ewing 肉瘤發(fā)病機(jī)制中的信號(hào)通路奠定了基礎(chǔ)。

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