覃 敏，黃 林，李慕軍，莫曾南*

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.人類精子庫;2.生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣西南寧530021)

男性不育癥總發(fā)病率逐年升高，其中精子形態(tài)異常引起的不育或生殖力低下的占男方因素的30%～40%［1］。目前，能有效治療男性不育癥的方法是輔助生殖技術(shù)，但對(duì)于內(nèi)源性生殖細(xì)胞缺如無精子癥或精子畸形綜合征患者，ART 或藥物治療無效［2］。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)可誘導(dǎo)分化為成體器官不同胚層的所有細(xì)胞，因此誘導(dǎo)ESCs 在體外分化為雄性生殖細(xì)胞，可以為生殖發(fā)生提供一個(gè)理想的平臺(tái)［3］。而結(jié)合胚胎干細(xì)胞技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)，可在體外培育出與患者遺傳特征完全相同的核移植胚胎干細(xì)胞(nuclear transfer embryonic stem cells，NT-ESCs)，為男性不育提供種子細(xì)胞的新來源。

NT-ESCs 理論上可分化為各個(gè)組織，但男性生殖細(xì)胞分化的研究尚少［4-5］。本研究旨在探討雄性生殖細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化條件及分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性C57BL/6 小鼠25 g，雌性BALB/c 小鼠25 g［上海斯萊克動(dòng)物有限公司，許可證號(hào):SCXK(滬)2003-000］。RA、LIF、H-DMEM、bFGF、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、絲裂霉素C 等(Sigma 公司)。cleavage medium、blastocyst medium(Sage BioPharma公司)。

1.2 NT-ESCs 的培養(yǎng)和鑒定

構(gòu)建核移植胚胎并檢測其DNA 來源［6］。重構(gòu)胚常規(guī)培養(yǎng)，挑取形態(tài)典型，未分化的NT-ESCs 集落傳代。經(jīng)形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、類胚體實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)分化方法鑒定。

1.3 NT-EBs 細(xì)胞誘導(dǎo)分化

培養(yǎng)3～4 d 后的NT-EBs 接種于鋪有0.1%明膠的24 孔板。加入含2 μmol /L RA、1 000 U/mL LIF、20 ng/ mL 成纖維細(xì)胞生長因子、30 ng/mL 干細(xì)胞生長因子、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、0.1 mmol/L β 巰基乙醇，2 mmol/ L 谷氨酰胺的高糖DMEM 培養(yǎng)液，誘導(dǎo)其向雄性生殖細(xì)胞分化，觀察NT-EBs 生長和形態(tài)變化。設(shè)4 組對(duì)照組:1)未分化的NT-ESCs;2)分化培養(yǎng)前的NT-EBs;3)無共培養(yǎng)、自主分化的NT-EBs;4)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。

1.4 RT-PCR 法檢測誘導(dǎo)后雄性生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

收集培養(yǎng)的NT-EBs 提取總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列及退火溫度見表1。PCR 參數(shù):95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃45 s，55 ℃～67 ℃45 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。產(chǎn)物電泳，結(jié)果以目的基因/β-actin 條帶密度比值表示(n=6)。

1.5 間接免疫熒光染色法檢測VASA、Scp3 蛋白的表達(dá)

共培養(yǎng)12 d 后按間接免疫熒光法，檢測分化組和對(duì)照組NT-EBs 的VASA、Scp3 蛋白表達(dá)，顯微鏡下觀察并照相。判斷標(biāo)準(zhǔn):(－)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱，但清楚可見;(+ +)熒光明亮;(+ + +～+ + + +)熒光閃亮。

表1 引物序列和退火條件Table 1 Primer sequences and annealing temperature

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NT-ESCs 的鑒定

NT-ESCs 呈橢圓形或鳥巢狀細(xì)胞集落，邊緣清晰(圖1);AKP 染色呈強(qiáng)陽性，集落呈深藍(lán)色(圖2A);細(xì)胞具有20 對(duì)染色體核型的結(jié)構(gòu)(圖2B);NT-ESCs懸浮培養(yǎng)能形成簡單的NT-EBs，較為致密，形態(tài)規(guī)則(圖2C);體內(nèi)注射NT-ESCs 可形成畸胎瘤，腫瘤包含源自3 個(gè)胚層分化的衍生物(圖2，D，E，F(xiàn))。

2.2 NT-EBs 體外誘導(dǎo)的生長觀察

NT-EBs 呈圓球狀懸浮于ESCs 培養(yǎng)液，細(xì)胞透亮活性好，大小比較均一，內(nèi)部細(xì)胞致密，邊緣規(guī)則(圖3A)。分化培養(yǎng)第4 天部分細(xì)胞由梭形或桿狀變?yōu)閳A錐形，培養(yǎng)7 和12 d 的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，大而圓形細(xì)胞增多(圖3C，D)。

2.3 RT-PCR 檢測雄性生殖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

圖1 NT-ESCs 形態(tài)學(xué)特征Fig 1 The morphology of NT-ESCs

圖2 NT-ESCs 的鑒定Fig 2 Identification of NT-ESCs

誘導(dǎo)12 d 后的NT-EBs 能夠表達(dá)雄性生殖細(xì)胞相關(guān)的特征基因(VASA、Scp3、Sry、Tex14)。與未分化NT-ESCs(0.68 ± 0.03)相比，誘導(dǎo)后Oct4 的mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.31 ±0.06，呈下調(diào)趨勢;Vasa，Scp3 和Sry mRNA 相對(duì)表達(dá)量為:1.03 ±0.08、0.95 ±0.07、1.03 ±0.06，明顯上調(diào)(P＜0.05)。在誘導(dǎo)前和自然分化的NT-EBs 中幾乎未能檢測到Texl4 的表達(dá)。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞均不表達(dá)上述相關(guān)基因(圖4)。

圖3 NT-EBs 體外誘導(dǎo)的生長觀察Fig 3 Morphology of NT-EBs cultured in vitro

圖4 RT-PCR 檢測雄性生殖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)Fig 4 mRNA expression of the genes involved in male germ cells development in NT-ESCs(RT-PCR)

2.4 NT-EBs 細(xì)胞VASA 和Scp3 蛋白的表達(dá)

誘導(dǎo)后第12 天即可見NT-EBs 細(xì)胞表達(dá)VASA(+)和Scp3 (+)，細(xì)胞成簇分布，部分細(xì)胞呈現(xiàn)一字形排列;在自然分化對(duì)照組NT-EBs 中，未見Scp3 陽性細(xì)胞，微弱表達(dá)VASA (±)(圖5)。

圖5 NT-EBs 細(xì)胞VASA 和Scp3 的表達(dá)Fig 5 VASA and Scp3 positive cells in NT-EBs(×200)

3 討論

多項(xiàng)研究提示，由ESCs 獲得精子的技術(shù)是可行的［5，7］，基于體細(xì)胞核移植技術(shù)與胚胎干細(xì)胞技術(shù)NT-ESCs 向男性生殖細(xì)胞分化有可能同時(shí)解決移植物來源和免疫排斥這兩大難題。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建成功的小鼠NT-ESCs 符合小鼠胚胎干細(xì)胞的一系列特性并具有多能性，這為進(jìn)一步研究組織修復(fù)及再生提供了技術(shù)平臺(tái)。

雖然ESCs 已證實(shí)可誘導(dǎo)分化為雄性生殖細(xì)胞，但分化的效率非常低［8］。既往研究大多采用微環(huán)境對(duì)ESCs 進(jìn)行體外誘導(dǎo)，能使細(xì)胞在三維空間結(jié)構(gòu)中進(jìn)行移動(dòng)并且與微環(huán)境相互作用。例如，用骨形態(tài)發(fā)生蛋白4BMP4、RA 誘導(dǎo)［9-10］，或?qū)SCs體外誘導(dǎo)為原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)而分化成雄性生殖細(xì)胞［11］。目前使用最多的方法是采用EB 的形式，其含有3 個(gè)胚層的細(xì)胞類型，提供了三胚層細(xì)胞間的相互接觸模型。目前體外形成EB 的微環(huán)境能夠支持生殖細(xì)胞的發(fā)育，并能消除生殖細(xì)胞發(fā)育早期親緣印跡［12］。在本實(shí)驗(yàn)中我們模擬體內(nèi)微環(huán)境，并經(jīng)RA 誘導(dǎo)增殖，研究了胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化情況。

本實(shí)驗(yàn)檢測了4 種NT-ESCs 和雄性生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因，Oct4 為NT-ESCs 特異性基因;VASA、Scp3、Sry 和Tex14 這4 個(gè)基因?yàn)樯诚到y(tǒng)特異性表達(dá)基因，特別在精子發(fā)生中起著重要作用。經(jīng)誘導(dǎo)后，NT-ESCs 的Oct4 表達(dá)減弱，VASA、Scp3、Sry 和Tex14 基因逐漸開始表達(dá)，說明RA 可促進(jìn)NT-ESCs 表達(dá)雄性生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因。同時(shí)，誘導(dǎo)后的NT-ESCs 表達(dá)雄性生殖細(xì)胞標(biāo)志蛋白VASA和Scp3，與報(bào)道類似［13］。以上結(jié)果提示RA可誘導(dǎo)NT-ESCs 向雄性生殖細(xì)胞分化，NT-ESCs 具備向中胚層細(xì)胞分化的潛能。但是，本研究分化后的細(xì)胞雖表現(xiàn)出雄性生殖細(xì)胞的相關(guān)蛋白，僅僅是一種前祖細(xì)胞，而非一種特定的生殖細(xì)胞。

目前，NT-ESCs 技術(shù)仍具有優(yōu)勢，核移植技術(shù)已可生成人類胚胎干細(xì)胞，這一成果具有里程碑意義［14］。因此，進(jìn)一步精確、規(guī)范、增殖和鑒定分化中所涉及到的重要蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)，篩選出影響誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵因素，對(duì)NT-ESCs 的定向誘導(dǎo)分化不僅在理論上且在實(shí)踐中均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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