徐 芬，康 健，陳 冬，馬曉峰

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧錦州121001)

鼻息肉(nasal polyps，NPs)是耳鼻咽喉科的常見(jiàn)病及多發(fā)病，主要表現(xiàn)為鼻-鼻竇黏膜的慢性病變，組織病理學(xué)特點(diǎn)為高度水腫的鼻-鼻竇黏膜，黏膜下血管及間質(zhì)增生，腺體分泌活躍及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。至今鼻息肉的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，相關(guān)研究認(rèn)為鼻息肉的發(fā)生與感染、過(guò)敏、纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能異常、微環(huán)境的改變、嗜酸粒細(xì)胞及細(xì)胞因子的增生有關(guān)，其中細(xì)胞因子在鼻息肉發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注，近年來(lái)的研究甚多，主要集中在促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，而細(xì)胞凋亡的研究相對(duì)較少，本研究通過(guò)研究3 種重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2，Bax 及caspase-9，從基因和蛋白兩個(gè)水平來(lái)探討細(xì)胞凋亡在鼻息肉發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集:鼻息肉組織來(lái)源于遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2012年01月至2013年10月接受手術(shù)的鼻息肉患者共41 例，男24 例，女17 例。年齡31～77 歲，平均54 歲。下鼻甲黏膜組織來(lái)源于慢性鼻炎的患者共26 例，男17 例，女9 例。年齡22～68 歲，平均45 歲。所有患者在手術(shù)前均詳細(xì)了解病情，所取組織標(biāo)本均經(jīng)患者及家屬同意后簽署知情同意書(shū)。手術(shù)取下的新鮮標(biāo)本部分立即投入－270 ℃的液氮中保存，留做RT-PCR 反應(yīng)用，一部分用甲醛固定48 h，石蠟包埋，做4 μm 切片。

所有患者術(shù)前2 周內(nèi)均未使用過(guò)皮質(zhì)類(lèi)固醇等藥物，變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺和血清特異性IgE 檢查結(jié)果為陰性，1年內(nèi)有鼻息肉手術(shù)及6 個(gè)月內(nèi)有鼻竇急性反應(yīng)或上呼吸道感染者被排除外。

1.2 方法

1.2.1 Real-time qRT-PCR:用Trizol 法提取總DNA，分光光度計(jì)測(cè)A260/A280的比值(平均＞1.8)，并定量。取0.5 μg 總RNA 按PrimeScript RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以β-actin 為內(nèi)參，使用ABI7900HT real time PCR 熒光定量PCR 儀，通過(guò)二步法SYBP Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的基因。PCR 擴(kuò)增:第一步:95 ℃30 s，一個(gè)循環(huán);第二步:95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本均繪制熔解度曲線。使用公式y(tǒng)=2－ΔΔCt對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.2 免疫組化部分:石蠟切片用SP 法按照試劑盒說(shuō)明分別進(jìn)行Bcl-2，Bax 及caspase-9 免疫組化染色，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物。每張切片在高倍顯微鏡下(×400)隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，取平均值作為該標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞率。每張切片均經(jīng)2 位病理科醫(yī)師進(jìn)行單盲法評(píng)估。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。qRT-PCR 結(jié)果應(yīng)用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫組化結(jié)果應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化:結(jié)果顯示鼻息肉中可見(jiàn)較多的Bcl-2 和Bax陽(yáng)性細(xì)胞，大部分聚集在鼻息肉的上皮層及血管腺體周?chē)?，而?duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)較少，細(xì)胞核多呈藍(lán)色;而鼻息肉中caspase-9 表達(dá)為弱陽(yáng)性，主要聚集在間質(zhì)細(xì)胞中，而對(duì)照組中陽(yáng)性細(xì)胞較多，明顯高于鼻息肉組(圖1，2，3)。

圖1 Bcl-2 蛋白在兩組中的表達(dá)Fig 1 The expression of Bcl-2 protein in two groups

2.2 鼻息肉組和對(duì)照組中Bcl-2、Bax、caspase-9 mRNA 的表達(dá)結(jié)果及免疫組化陽(yáng)性率結(jié)果(表1，2)。

圖2 Bax 蛋白在兩組中的表達(dá)Fig 2 The expression of Bax protein in two groups

圖3 Caspase-9 蛋白在兩組中的表達(dá)Fig 3 The expression of caspase-9 protein in two groups

表1 鼻息肉組和對(duì)照組中Bcl-2、Bax、caspase-9 mRNA 的表達(dá)結(jié)果Table 1 The Bcl-2，Bax and caspase-9 mRNA expression level in different groups(±s，n=67)

表1 鼻息肉組和對(duì)照組中Bcl-2、Bax、caspase-9 mRNA 的表達(dá)結(jié)果Table 1 The Bcl-2，Bax and caspase-9 mRNA expression level in different groups(±s，n=67)

＊P＜0.05 compaired with control.

groupBcl-2Baxcaspase-9 control1.65 ±0.201.14 ±0.181.18 ±0.17 NPs4.02 ±0.62*1.94 ±0.38*0.84 ±0.06*

表2 鼻息肉組和對(duì)照組中Bcl-2、Bax、caspase-9免疫組化陽(yáng)性率結(jié)果Table 2 The positive expression rate of Bcl-2，Bax，caspase-9 in different groups［±s(%)，n=67］

表2 鼻息肉組和對(duì)照組中Bcl-2、Bax、caspase-9免疫組化陽(yáng)性率結(jié)果Table 2 The positive expression rate of Bcl-2，Bax，caspase-9 in different groups［±s(%)，n=67］

＊P ＜0.05 compaired with control．

groupBcl-2Baxcaspase-9 control38.46 ±1.2946.15 ±1.9142.31 ±1.20 NPs87.80 ±2.32*75.61 ±2.07*24.39 ±1.02*

2.3 Bcl-2 在鼻息肉中的表達(dá)與bax 表達(dá)的相關(guān)性:鼻息肉組織中Bcl-2 的表達(dá)與bax 的表達(dá)存在正相關(guān)趨勢(shì)(P＜0.05)。

3 討論

鼻息肉的病因至今仍不明確，大多數(shù)研究提示鼻息肉的發(fā)病與鼻及鼻竇黏膜的過(guò)度增生有關(guān)，促進(jìn)鼻息肉增生的細(xì)胞因子多達(dá)幾十種，但是有關(guān)細(xì)胞凋亡在鼻息肉中的研究較少［1］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果Bcl-2 在鼻息肉中絕大多數(shù)表達(dá)陽(yáng)性，鼻息肉組織中Bcl-2 與Bax 陽(yáng)性表達(dá)率的比值為1.16，說(shuō)明鼻息肉細(xì)胞中細(xì)胞凋亡受到抑制，而鼻息肉中caspase-9 表達(dá)水平較低，鼻息肉組織中細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)受到抑制。

目前鼻息肉的治療主要集中在手術(shù)切除和類(lèi)固醇激素的使用，對(duì)于長(zhǎng)期使用激素，即使是低劑量局部應(yīng)用，激素的不良反應(yīng)也同樣引起人們的重視，目前低劑量局部應(yīng)用氨甲喋呤(MTX)治療鼻息肉，尤其是激素依賴型鼻息肉的患者，取得一定的療效［2］，甲氨蝶呤(MTX)在鼻息肉中作用機(jī)制與caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［3］，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為甲氨蝶呤(MTX)在鼻息肉中的治療提供了一定的理論依據(jù)，同時(shí)為探討鼻息肉的病因及治療提供了新的思路。細(xì)胞凋亡是極為復(fù)雜的生理過(guò)程，隨著細(xì)胞凋亡相關(guān)研究的深入，對(duì)鼻息肉的發(fā)病機(jī)制及治療提供幫助。

［1］張海令，許安廷，范獻(xiàn)良.鼻息肉中LIVIN、SMAC 的表達(dá)及其意義［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，50:0112-0114.

［2］Buyukozturk S，Gelincik A，Aslan I，et al.Mehotrexate:can it be a choice for nasal polypsis in aspirin exacerbated respiratory disease［J］.Asthma，2009，46:1037-1041.

［3］Cho HW，Park SK，Heo KW，et al.Methotrexate induces apoptosis in nasal polyps via caspase cascades and both mitochondria-mediated and p38 mitogen-activated protein kinases/Jun N-terminal kinase pathways［J］.Am J Rhinol Allergy，2013，27:26-31.