張亞樓，孫小娜，李 甜，馮樹梅，廖禮彬，鄧 鋒，鐘近潔*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，新疆烏魯木齊830011;2.新疆疾病預(yù)防控制中心放射衛(wèi)生科，新疆烏魯木齊830011)

攝入過量氟能夠引起成年人氟骨癥。研究發(fā)現(xiàn)氟可以誘導(dǎo)成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時會對成骨細胞的骨發(fā)生作用產(chǎn)生影響［1］。將氟誘導(dǎo)的成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與骨轉(zhuǎn)化基因進行聯(lián)合系統(tǒng)的研究未見報道。本研究用PCR 芯片觀察成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下骨轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的變化，為探索氟中毒機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料:NaF，分析純(上海生工公司)、RNeasy Plus Mini Kit、RT2 First Strand Kit 和RT2 SYBR Green qPCR Mastermix、PCR 芯片(未折疊蛋白反應(yīng)PAHS-089ZA-2 和骨發(fā)生信號通路PAHS-026ZA-2)(Qiagen 公司)。

1.2 細胞培養(yǎng):原代培養(yǎng)人成骨細胞(鐘近潔教授贈送)，細胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行貼壁培養(yǎng)。

1.3 凋亡細胞的流式細胞儀檢測:將成骨細胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細胞長至鏡下細胞匯合度為80%時，加入氟化鈉(NaF)(0 和10 mg/L)作用24 h 后，制成單細胞懸液，用AnnexinⅤ和PI 雙染色在流式細胞儀上進行早期細胞凋亡的檢測。

1.4 PCR 芯片檢測:用NaF 干預(yù)成骨細胞24 h 后，提取RNA。分光光度計測定其濃度，瓊脂糖凝膠電泳測定其RNA完整性。取400 ng RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加樣于PCR 芯片上，于熒光定量PCR 儀上進行實時定量PCR 反應(yīng)。計算每張PCR 芯片中的每個基因的Ct 值。每種處理組重復(fù)用PCR芯片測定3 次。采用2－ΔΔCt方法比較相應(yīng)基因的表達量變化。表達量差異在2 倍以上者為差異有意義基因。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀檢測凋亡結(jié)果:當(dāng)氟化鈉濃度為10 mg/L時，人成骨細胞凋亡率為14.2 %。

2.2 未折疊蛋白反應(yīng)PCR 芯片結(jié)果:在總共84 個檢測基因中表達下調(diào)的有:FBXO6 基因;表達上調(diào)的有:BIP、XBP1、ATF4、PERK、IRE1α、IRE1β、ERO1LB、JNK3、PDIA3、USP14、HSPA1L、HSPH1、HTRA4 和UGCGL1 等14 個基因。

2.3 骨發(fā)生PCR 芯片結(jié)果:表達上調(diào)的基因有:AHSG、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALPL)、二聚糖(biglycan，BGN)、BMP2、BMP3、BMP5、BMP6、BMP7、降鈣素受體(calcitonin receptor，CALCR)、脊索蛋白(chordin，CHRD)、COL10A1、COL1A1、COL2A1、COL5A1、軟骨寡聚物基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)、DLX5、FLT1(VEGFR-1)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N1)、GDF10、IGF1、IGF2、IHH、ITGA2(integrin alpha 2)、ITGAM(CD11B/integrin alpha M)、MMP10、MMP9、PDGFA、PHEX、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、TNF、TNFSF11、VEGFA;表達下調(diào)的基因有:NOG、VCAM1。其中:BMP2、BMP3、BMP5、BMP6、BMP7 屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族;COL10A1、COL1A1、COL2A1、COL5A1 屬于膠原家族;IGF1、IGF2 屬于胰島素樣生長因子家族;ITGA2、ITGAM 屬于整合素α 家族;MMP10、MMP9 屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族;TNF、TNFSF11 屬于腫瘤壞死因子家族;FLT1 和VEGFA 屬于血管生長因子家族。各基因間的相互關(guān)系根據(jù)軟件繪制如圖1。

3 討論

熒光定量PCR Array 是目前較為簡單實用的檢測基因表達的方法，能夠1 次性檢測84 個與UPR 相關(guān)的基因在mRNA水平上的表達，結(jié)果無需再進行實時熒光定量檢測，可同時研究信號通路的大量基因。本研究利用這一技術(shù)研究氟化鈉作用下成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和骨發(fā)生信號通路，完整地了解這兩面的變化情況。

從實驗結(jié)果看，氟化鈉誘導(dǎo)了人成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其標(biāo)志分子BIP 和XBP1 均表達;此外誘導(dǎo)了3 條信號通路:PERK、IRE1 和ATF6，3 種分子均高表達。檢出的ATF4 則屬于PERK-Eif2α 途徑下游的分子。說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及未折疊蛋白反應(yīng)被過量氟激活，以減輕未折疊蛋白質(zhì)的堆積，避免后者造成細胞損傷。

圖1 各骨轉(zhuǎn)化基因間的相互關(guān)系圖Fig 1 The interaction of bone turn-over genes

成骨細胞在過量氟作用下，激發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時對成骨細胞分化也產(chǎn)生了影響。本研究結(jié)果很多已經(jīng)獲得了證實，如:氟對成骨細胞的BMP 家族分子的影響已被證實;對膠原家族的影響也已經(jīng)證實［2］;本研究中氟對降鈣素的影響與報道一致;而氟對MMP9 和VEGF 等影響也與以往報道相符［3］。對于氟作用下的DLX5(Dlx5 屬于同源異型盒homeobox，Hox 基因家族)已有研究［4］。以上說明本研究結(jié)果是可靠的。

通過PCR 芯片研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟中毒研究中許多以前被孤立研究的基因相互間是有關(guān)聯(lián)的，同時還發(fā)現(xiàn)了以前忽略的方面如整合素等，這也指出了今后研究的方向。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了氟對成骨細胞分化的作用。

［1］Zhou YL，Shi HY，Li XN，et al.Role of endoplasmic reticulum stress in aberrant activation of fluoride-treated osteoblasts［J］.Biol Trace Elem Res，2013，154:448-56.

［2］張亞樓，劉開泰，劉繼文，等.氟對成骨細胞Runx2 和Osterix 表達的影響［J］.中國地方病學(xué)雜志，2011，30:23-26.

［3］申慶豐，李輝南，徐天同，等.慢性氟中毒大鼠脊髓血腦屏障損傷的研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2012，92:2357-2361.

［4］萬良斌，于燕妮，萬昌武.同源異型盒基因Dlx5 在氟中毒骨代謝中作用［J］.中國公共衛(wèi)生，2013，29:620-622.