王 嬋，王新敏，章 樂，季 榕，吳江東，吳 芳，張萬江

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室;2.病理生理教研室;3.第一附屬醫(yī)院泌尿外科;4.第一附屬醫(yī)院感染科;5.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆石河子832002)

長期以來各國一直使用卡介苗(Bacillus Calmette Gerin)來預(yù)防結(jié)核病，但BCG 在不同地區(qū)的免疫保護效果差異顯著，序貫免疫策略是單用一種疫苗產(chǎn)生的免疫效力不足時，使用相同或不同的疫苗來重復(fù)免疫接種可增強免疫效果［1-2］。本研究利用已經(jīng)構(gòu)建好的表達免疫調(diào)節(jié)因子的質(zhì)粒(IL-12)作為在接種BCG 后連續(xù)使用，以觀察BCG 初次免疫后IL-12 進行免疫加強的免疫效果。

1 材料與方法

IL-4 和IL-2 含量。

2 結(jié)果

2.1 各組血清特異性抗體IgG 的比較:免疫后BCG 組、BCG/IL-12 組和BCG/pcDNA3.1 組在3 個時間點的IgG 較同時間段對照組均有顯著升高(P＜0.05)。其中，BCG/IL-12組IgG 高于其他各組(P＜0.05)(圖1)。

1.1 材料:SPF 級6～8 周齡BALB/c 雌性小鼠24 只，由［新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，使用許可證號SYXK(新)2003-0001］。IL-12 是以pcDNA3.1 為載體構(gòu)建的表達型重組質(zhì)粒(本實驗室構(gòu)建保存)。BCG(本實驗室常規(guī)保存培養(yǎng))。

1.2 方法

1.2.1 動物免疫:將小鼠隨機分為PBS 對照組、BCG 組、BCG/IL-12 組、和BCG/pcDNA3.1 組，每組6 只。給4 組小鼠分別在第1 周注射PBS、BCG、BCG 及BCG，第3 和5 周分別注射PBS、PBS、IL-12、pcDNA3.1。

1.2.2 特異性抗體IgG 的檢測(ELISA 法):以PBS 組小鼠血清作為陰性對照，將抗體滴度定義為:實驗組和陰性對照組A490比值≥2.0 時為最大血清稀釋倍數(shù)。

1.2.3 特異性淋巴細(xì)胞增殖實驗(MTT 法):加強免疫后4，6 和8 周，每組分別取2 只小鼠，脾細(xì)胞混合后分孔培養(yǎng)，實驗組加入PPD(1 μg/mL)刺激，培養(yǎng)結(jié)束前4 h 加XTT(5 g/L)4 μL 及VK3 2 μL(終濃度0.1 mmol/L)，培養(yǎng)終止后測定A450nm吸光度值，結(jié)果用刺激指數(shù)(stimulation index，SI)表示。SI=A實驗值/A對照組。

1.2.4 細(xì)胞因子的誘生和測定:同樣制備的脾細(xì)胞做5 個復(fù)孔，TB-PPD 進行刺激，按說明書操作，檢測樣品中IFN-γ、

2.2 特異性脾淋巴細(xì)胞增殖實驗:加強免疫后，BCG 組、BCG/IL-12 組和BCG/pcDNA3.1 組在3 個時間點的增殖活性均顯著高于對照組(P＜0.05)。與加強免疫后4 周相比，加強免疫后6 和8 周BCG/IL-12 組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖均呈上升趨勢，并且在加強免疫后8 周達到較高水平(圖2)。

圖2 特異性脾淋巴細(xì)胞增殖實驗Fig 2 Lymphoproliferative response to these types of vaccines

2.3 細(xì)胞因子表達水平:在加強免疫后6、8 周時間點BCG/IL-12 組的IFN-γ、IL-2、IL-4 水平均高于其他各組(P＜0.05)(表1，2，3)。

表1 IFN-γ 變化水平Table 1 The changes of IFN-γ level in culture medium to these types of vaccines(±s，pg/mL，n=5)

表1 IFN-γ 變化水平Table 1 The changes of IFN-γ level in culture medium to these types of vaccines(±s，pg/mL，n=5)

＊P＜0.05 compared with PBS group;#P＜0.05 compared with BCG.

group4 weeks6 weeks8 weeks PBS62.2 ±10.359.2 ±8.061.6 ±8.0 BCG88.4 ±9.5*99.6 ±11.3* 115.6 ±14.6*BCG/IL12106.4 ±24.1*146.4 ±14.1* # 165.6 ±27.4* #BCG/pcDNA3.1 85.8 ±9.3*99 ±10.6*104.2 ±24.0*

3 討論

結(jié)核桿菌的保護性免疫主要是細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)更為強烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答是目前結(jié)核病疫苗研究的熱點。IL-12 作為對體內(nèi)免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用最強、范圍最廣的細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)Th0 細(xì)胞向Th1 型細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，可明顯增強細(xì)胞免疫功能［3］。故本實驗采用已經(jīng)構(gòu)建好的表達IL-12 在BCG 初次免疫后對小鼠進行加強免疫，結(jié)果顯示，采用BCG 初免并用IL-12 加強后IgG 水平開始升高，且6 和8 周后小鼠血清中抗PPD IgG 水平顯著高于BCG 組。并可誘導(dǎo)較強的淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生高水平的IFN-γ 及IL-2。這些結(jié)果提示，IL-12 可改善傳統(tǒng)BCG 對機體細(xì)胞免疫的刺激作用，進而產(chǎn)生高水平的IFN-γ，增強BCG 的免疫效應(yīng)，共同促進機體產(chǎn)生較傳統(tǒng)BCG 免疫更明顯和維持時間更長的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

表2 IL-2 變化水平Table 2 The changes of IL-2 level in culture medium to these types of vaccines (±s，pg/mL，n=5)

表2 IL-2 變化水平Table 2 The changes of IL-2 level in culture medium to these types of vaccines (±s，pg/mL，n=5)

＊P＜0.05 compared with PBS group;#P＜0.05 compared with BCG group.

group4 weeks6 weeks8 weeks PBS29.8 ±2.825.8 ±4.827.6 ±3.1 BCG108.2 ±17.5* 159.4 ±21.7*223 ±13.1*BCG/IL-12123.6 ±19.6* 227.4 ±23.5* #312.4 ±33.0* #BCG/pcDNA3.1 107.2 ±14.0* 152.6 ±21.4*219.4 ±18.2*

表3 IL-4 變化水平Table 3 The changes of IL-4 level in culture medium to these types of vaccines (±s，pg/mL，n=5)

表3 IL-4 變化水平Table 3 The changes of IL-4 level in culture medium to these types of vaccines (±s，pg/mL，n=5)

＊P＜0.05 compared with PBS group.

group4 weeks6 weeks8 weeks PBS23 ±5.719.6 ±2.44.2 ±2.6 BCG41 ±6.6*57.6 ±7.9*71 ±2.6*BCG/IL-1247.2 ±5.5*51.4 ±7.2*63.8 ±8.8*BCG/pcDNA3.137.4 ±3.2*54.2 ±7.0*66.2 ±7.0*

［1］Yang HJ，Chen JY，Shi HJ，et al.Comparative study on different immune schemes of inactivated poliovirus vaccines prepared with Sabin and wild strains in rhesus monkeys［J］.Chinese J Biol，2013，26:750-753.

［2］Dye C，Willams BG.The population dynamics and control of tuberculosis［J］.Science，2010，328:856-861.

［3］Ling W，Wang XF.In vitro induction of specific anti-tumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene transfected dendritic cells［J］.Chinese Med J，2011，9:1357-1361.doi:10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2011.09.016.