周思靜，李 敏，王 苒，許 銳，費(fèi)黎明，祝清清，張 燕

(1.合肥市第三人民醫(yī)院職業(yè)病科，安徽合肥230001;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科安徽合肥230001;3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，安徽合肥230001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎性反應(yīng)為特征［1］。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一種新發(fā)現(xiàn)的生長因子，近年來，有研究結(jié)果表明，結(jié)締組織生長因子還參與調(diào)節(jié)多種炎性反應(yīng)［2］。本研究探討COPD 的肺組織中CTGF 表達(dá)差異，為研究吸煙人群的COPD易患機(jī)制提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料:肺組織標(biāo)本來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科2012年1月至2012年12月因肺部占位性病變行肺葉切除術(shù)的患者。將標(biāo)本分為3 組(每組25 例):1)吸煙+COPD 組:均為吸煙的COPD 患者，均符合COPD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且處于穩(wěn)定期。2)吸煙組:均為未患COPD 的吸煙者。3)對照組:均無職業(yè)性粉塵與化學(xué)物質(zhì)接觸式，均無吸煙史，且未患COPD。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)，在采集標(biāo)本前均告知研究對象，并獲得其本人同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑:兔抗人CTGF 多克隆抗體、小鼠抗人-肌動(dòng)蛋白抗體(Santa Cruz 公司)，Trizol 試劑(Invitrogen 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒(Toyobo 公司)，SDS-PAGE 試劑盒、組織蛋白提取試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，蛋白標(biāo)志物(Fenmentas 公司)。所有引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成。

1.2.2 采集組織標(biāo)本:收集行肺葉切除手術(shù)后的肺組織標(biāo)本，所取標(biāo)本均遠(yuǎn)離病變(＞5 cm)，且肉眼觀察無癌組織浸潤。

1.2.3 熒光定量PCR 檢測mRNA 表達(dá):定量PCR 的結(jié)果采用2－ΔΔCt法來測定目的基因的相對表達(dá)。

1.2.4 免疫組化:石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，用兔抗人CTGF多克隆抗體作為一抗(Santa Cruz Biotechnology)，稀釋度為1∶200。按試劑盒說明書操作。

1.2.5 Western blot 蛋白表達(dá):取肺組織加入組織蛋白提取試劑，取等量蛋白上樣，以β-actin 為內(nèi)參照，用10%的SDSPAGE 凝膠電泳后，截取含CTGF 蛋白和β-actin 蛋白的凝膠，將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后，加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入相應(yīng)的二抗孵育，洗膜后顯影，用Quantity One 軟件處理系統(tǒng)分析各條帶的吸光度值(A)，計(jì)算蛋白相對表達(dá)量(CTGF/內(nèi)參的吸光度比值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué):采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson 相關(guān)分析方法。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較:吸煙+COPD 組的FEV1 占預(yù)計(jì)值百分比、FEV1/FVC 均顯著低于對照組和吸煙組(表1)。

表1 各組研究對象臨床資料Table 1 Clinical data from three groups(±s，%，n=25)

表1 各組研究對象臨床資料Table 1 Clinical data from three groups(±s，%，n=25)

＊P＜0.05 compared with control and smoker.

groupFEV1 pred(%，images/BZ_3_296_691_329_735.png±s)FEV1/FVC(%)control104.5 ±13.781.2 ±5.3 smoker93.3 ±11.279.8 ±7.8 smoker+COPD74.6 ±10.4*63.1 ±6.1*

2.2 肺組織中CTGF 的mRNA 的表達(dá):吸煙+COPD 組研究對象肺組織中CTGFmRNA 表達(dá)水平為4.28 ±0.43，高于吸煙組的(2.45 ±0.37，P＜0.05)，而吸煙組又高于不吸煙對照組的(1.02 ±0.15，P＜0.05)。

2.3 肺組織中CTGF 的表達(dá):CTGF 表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、小血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。

圖1 肺組織中CTGF 的表達(dá)。Fig 1 CTGF expression in lung tissues (×400)

2.4 肺組織中CTGF 的蛋白表達(dá):吸煙+COPD 組肺組織的CTGF 的蛋白表達(dá)為3.07 ±0.42 顯著高于吸煙組的1.74 ±0.26(P＜0.05)和對照組的0.61 ±0.11(P＜0.05)。

2.5 CTGF 表達(dá)與肺功能的相關(guān)性:肺組織中CTGFmRNA表達(dá)量與FEV1 占預(yù)計(jì)值%和FEV1/FVC 均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05);肺組織中CTGF 的蛋白表達(dá)量與FEV1 占預(yù)計(jì)值%和FEV1/FVC 均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

圖2 Western blot 法檢測各組肺組織中CTGF 的蛋白表達(dá)Fig 2 CTGF protein expression in lung tissues from groups using Western blot

3 討論

吸煙是目前公認(rèn)的導(dǎo)致COPD 發(fā)病的最重要危險(xiǎn)因素，但僅有少部分吸煙者罹患COPD，提示吸煙者自身易感因素存在差異。有相關(guān)研究表明，結(jié)締組織生長因子CTGF 廣泛參與炎性細(xì)胞的募集或血管生成，進(jìn)而在炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用［3］。

本研究顯示，在吸煙組的肺組織中，CTGF 的mRNA 和蛋白表達(dá)較少，但吸煙+COPD 組的肺組織中CTGF 的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加(圖2)，提示CTGF 可能參與COPD 的炎性反應(yīng)。CTGF 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平還與肺部氣流受限存在正相關(guān)關(guān)系，提示CTGF 升高與吸煙導(dǎo)致的肺部慢性炎性反應(yīng)有一定關(guān)系。CTGF 參與吸煙誘導(dǎo)的COPD 患者慢性肺部炎性反應(yīng)的機(jī)制，可能與CTGF 促進(jìn)和激活TNF、IL-6、IL-8 和MCP1 等炎性因子和趨化因子的生成［4］、增加炎性細(xì)胞趨化性、附著性有關(guān)。

總之，本研究證實(shí)，CTGF 在肺組織中的表達(dá)與肺功能呈負(fù)相關(guān)，吸煙的COPD 患者肺組織中CTGF 表達(dá)明顯高于吸煙未患COPD 者，提示CTGF 在肺組織中的表達(dá)與COPD 有一定相關(guān)性，但CTGF 的表達(dá)和吸煙致COPD 的發(fā)病是否存在一定程度的因果關(guān)系尚需進(jìn)一步闡明，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究CTGF 在吸煙致COPD 發(fā)病機(jī)制中的作用提供了前期理論依據(jù)，值得進(jìn)一步探討。

［1］Chung KF and Adcock IM.Multifaceted mechanisms in COPD:inflammation，immunity，and tissue repair and destruction［J］.Eur Res J，2008，31:1334-1356.

［2］Kular L，Pakradouni J，Kitabgi P，et al.The CCN family:a new class of inflammation modulators?［J］.Biochimie，2011，93:377-88.

［3］Bai T，Chen CC，Lau LF.Matricellular protein CCN1 activates a proinflammatory genetic program in murine macrophages［J］.J Immunol，2010，184:3223-3232.

［4］Wang X，McLennan SV，Allen TJ，et al.Regulation of pro-inflammatory and pro-fibrotic factors by CCN2/CTGF in H9c2 cardiomyocytes［J］.J Cell Commun Signal，2010，4:15-23.