嚴(yán)潔萍，俞 佳，吳 越，呂良忠，2*

(1.浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥學(xué)室，浙江杭州310014;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，浙江杭州310053)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glucose transporter，GLUT)是一類調(diào)控細(xì)胞外葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的跨膜蛋白家族，參與糖代謝，炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答等過程［1］。本研究前期已發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysacchride，LPS)可致內(nèi)毒素血癥［2］，引起代謝因子應(yīng)激變化［3-4］，影響葡萄糖吸收和GLUT1 表達(dá)變化［5］。病理狀態(tài)GLUT 表達(dá)豐度和變化趨勢都不盡相同，其分布和功能具有潛在的選擇特異性值得進(jìn)一步探討。

低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)參與調(diào)控GLUT 表達(dá)，HIF-1 活性調(diào)節(jié)依賴于HIF-1的穩(wěn)定表達(dá)。前期已發(fā)現(xiàn)LPS 促ALD A 表達(dá)呈HIF-1 依賴性上調(diào)［2］，提示HIF-1 可參與調(diào)控葡萄糖代謝。

本研究觀察LPS 對GLUT 家族表達(dá)影響及HIF-1可能的調(diào)控作用，以揭示GLUT 在病理狀態(tài)可能的生物學(xué)功能。

1 試劑與方法

1.1 主要試劑與材料

LPS(Sigma 公司);PMSF，aprotinin，leupeptin，丙烯酰胺，雙丙稀酰胺，Tris，甘氨酸，引物序列及RTPCR 反應(yīng)試劑(上海生工生物工程);IL-1 測定試劑盒(南京建成生物有限公司);硝酸纖維素膜(Milipore 公司);Western blot 所用二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗羊IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG 和β-actin 抗體(Santa Cruz Biotechnology 公司);ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce 公司);Lowry 法測蛋白含量試劑盒(Bio-Rad 公司);GLUT1 抗體(杭州安博公司);HIF-1抗體(ABCam 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～250 g［浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號:SCXK(浙)2004-0014］。

1.3 LPS 給藥、體溫檢測和樣本采集

大鼠12 只均分為對照組(腹腔注射0.9%氯化鈉注射液)及LPS 給藥組(注射2 mg/kg LPS)。LPS給藥后0、6、12、16 和24 h 檢測兩組大鼠肛溫。LPS作用24 h 后，下腔靜脈取血備用。處死大鼠，取其腦、心臟和肝等組織備用。

1.4 血清IL-1 水平檢測

取血后靜置30 min，3 000 ×g 離心5 min，取上清液備用。按試劑盒說明書檢測血清IL-1 水平。

1.5 RT-PCR 法檢測組織GLUT 家族mRNA表達(dá)

取新鮮組織，加入液氮碾磨，OMEGA 總RNA提取試劑盒提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄條件:RNA 3 μg，隨機(jī)引物2 μL，0.1% DEPC 補(bǔ)足至12 μL，65 ℃變性15 min。加入4 μL 反轉(zhuǎn)錄緩沖液，3 μL 10 mmol/L dNTP，40 U M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶，0.5 μL RNA酶抑制劑，25 ℃10 min、42 ℃1 h、72 ℃15 min 反轉(zhuǎn)錄得cDNA。PCR 的擴(kuò)增條件如下:5.0 μL 緩沖液;1.0 μL dNTP(10 mmol/L);上、下游引物各2 μL;cDNA 1.5 μL;0.5 μL Taq DNA 聚合酶(2.5 U);3 μL Mg2+溶液;水補(bǔ)至50 μL 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。各引物序列、退火溫度和循環(huán)輪數(shù)如表1 所示。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

表1 目標(biāo)基因引物序列以及PCR 擴(kuò)增條件Table 1 Primers and conditions for RT-PCR

1.6 Western blot 法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)

裂解液充分裂解組織，冰浴中反復(fù)吹打放置20～30 min，4 ℃13 000 × g 離心30 min。用Bio-Rad 試劑盒測定樣本蛋白溶液濃度。于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳1～2 h，用電轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上;5%脫脂牛奶封閉1 h;加入目標(biāo)蛋白一抗，4 ℃過夜;次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗1 h，采用ECL 法檢測印跡膜。Quantity OneTM4.2.2 分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LPS 對大鼠體溫及血清炎性因子影響

LPS 作用18 和24 h 可分別升高大鼠體溫(P＜0.05，P＜0.01)(圖1A);與對照組相比，LPS 作用24 h大鼠血清中IL-1 水平上調(diào)(P＜0.05)(圖1B)。

2.2 LPS 對GLUT 家族mRNA 表達(dá)的影響

GLUT1、GLUT2、GLUT3 和GLUT4 在腦組織均有表達(dá);LPS 明顯上調(diào)GLUT1 mRNA 水平(P＜0.05)(圖2A，B)。GLUT1 和GLUT4 在心臟組織有表達(dá);給LPS 后GLUT1 和GLUT4 mRNA 水平變化無顯著變化(圖2A，C)。GLUT1、GLUT2 和GLUT4 在肝臟組織中有表達(dá);LPS 對其肝臟GLUT 家族并無明顯影響(圖2A，D)。

2.3 GLUT1 和HIF-1 的表達(dá)

圖1 LPS 對大鼠體溫及血清IL-1 水平影響Fig 1 The body temperature and IL-1 level in serum in LPS-challenged rats(±s，n=6)

圖2 LPS 對大鼠腦、心臟和肝臟GLUT 家族mRNA 表達(dá)的影響Fig 2 Effects of LPS on GLUT family mRNA expression in brain，heart and liver in rats(±s，n=6)

對照組腦組織中，HIF-1 呈低水平表達(dá)或不表達(dá)，給LPS 后HIF-1 穩(wěn)定表達(dá)，較對照組顯著上調(diào)(P＜0.001)。在腦組織中，LPS 給藥組GLUT1 蛋白表達(dá)較對照組顯著上調(diào)(P＜0.05)，與HIF-1 表達(dá)一致(圖3A)。在心臟、肝臟中，對照組和LPS 組HIF-1 呈較低水平表達(dá)或不表達(dá);兩組GLUT1 表達(dá)均無變化(圖3B，C)。

圖3 LPS 對大鼠腦、心和肝等組織HIF-1 和GLUT1 蛋白表達(dá)的影響FigEffect of LPS on HIF-1 and GLUT1 protein expressions in brain，heart and liver in rats(n=6)

3 討論

GLUT 作為糖攝取的關(guān)鍵因子，其表達(dá)水平與機(jī)體糖代謝密切相關(guān)。本研究觀察到GLUT 家族在各器官的可能功能亞型:GLUT1 和GLUT4 在腦、心和肝組織中均有表達(dá);GLUT2 在腦、肝組織中表達(dá);GLUT3 僅在腦組織特異性表達(dá)。

研究報道通過激活白細(xì)胞上調(diào)GLUT1，GLUT3 和GLUT4 等表達(dá)從而影響糖吸收過程［6］。在LPS 敏感小鼠(C57BL/6)和LPS 抵抗小鼠(C3H/HeJ)模型中，LPS 影響腹膜和脾臟細(xì)胞的氧化代謝，也可激活腹膜巨噬細(xì)胞炎性因子，如TLR-1/MD-2 受體，CD14 受體和TNF-β 表達(dá)［7］。這種方式被認(rèn)為是一種免疫應(yīng)激反應(yīng)。本結(jié)果顯示LPS 可上調(diào)腦組織GLUT1 表達(dá)，提示GLUT1 表達(dá)變化可能與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，部分揭示了GLUT 家族作為應(yīng)激蛋白參與調(diào)控代謝的生物學(xué)本質(zhì)。低氧或應(yīng)激狀態(tài)均發(fā)現(xiàn)HIF-1 可通過調(diào)控GLUT 或催化酶控制糖酵解流量，為提供機(jī)體所需ATP［8］。本結(jié)果LPS 上調(diào)腦組織GLUT1 表達(dá)，與HIF-1 穩(wěn)定表達(dá)相平行，提示其表達(dá)可能受HIF-1 調(diào)控。

綜上所述，GLUT 家族在大鼠腦、心臟和肝臟組織中的表達(dá)具有器官特異性;LPS 可能通過促HIF-1 穩(wěn)定表達(dá)上調(diào)GLUT1 表達(dá)參與調(diào)控糖代謝過程。

［1］Garnett JP，Nguyen TT，Moffatt JD，et al.Proinflammatory mediators disrupt glucose homeostasis in airway surface liquid［J］.J Immunol，2012，189:373-380.

［2］Yan J，Shi Q，Chen Z，et al.Skeletal muscle aldolase an overexpression in endotoxemic rats and inhibited by GSNO via potential role for S-nitrosylation in vitro［J］.J Surg Res，2011，170:57-63.

［3］江麗麗，張建斌，謝平，等.LPS 預(yù)處理增加CoCl2 誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)HIF-1［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33:1297-1301.

［4］楊敏，姜明紅，高靜，等.miR-23a 對LPS 誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33:666-670.

［5］Tavakoli S，Zamora D，Ullevig S，et al.Bioenergetic Profiles Diverge During Macrophage Polarization:Implications for the Interpretation of 18F-FDG PET Imaging of Atherosclerosis［J］.J Nucl Med，2013，54:1661-1667.

［6］Reddy AB，Srivastava SK，Ramana KV.Aldose reductase inhibition prevents lipopolysaccharide-induced glucose uptake and glucose transporter 3 expression in RAW264.7 macrophages［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42:1039-1045.

［7］楊峰，周婭，曹相原，等.槐定堿抑制脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞系NF-κB 表達(dá)［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:1320-1325.

［8］Gessi S，Merighi S，Stefanelli A，et al.A and A adenosine receptors inhibit LPS-induced hypoxia-inducible factor-1 accumulation in murine astrocytes［J］.Pharmacol Res，2013，76:157-170.