陳永鋒 王海晶 劉丁瑗 周向東

1.第二軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院呼吸科，重慶400038；2.解放軍75600部隊(duì)醫(yī)院接診室，廣東深圳518048

小分子NEK2干擾RNA 對(duì)肺癌細(xì)胞耐藥的研究

陳永鋒1，2王海晶1劉丁瑗1周向東1

1.第二軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院呼吸科，重慶400038；2.解放軍75600部隊(duì)醫(yī)院接診室，廣東深圳518048

目的探討小分子NEK2干擾RNA（siRNA-NEK2）逆轉(zhuǎn)人肺癌耐藥細(xì)胞（A549/DDP）耐藥性的研究。方法應(yīng)用Real-time PCR法及Western blot法驗(yàn)證NEK2基因在人肺腺癌耐藥細(xì)胞系（A549/DDP）細(xì)胞系呈現(xiàn)高表達(dá)；并采用脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，將NEK2小片段RNA導(dǎo)入A549/DDP細(xì)胞沉默NEK2基因；應(yīng)用MTT法觀察順鉑、阿霉素對(duì)沉默NEK2基因后的A549/DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒活性變化。結(jié)果NEK2-mRNA、NEK2蛋白在A549/ DDP細(xì)胞系表達(dá)水平均顯著高于A549細(xì)胞系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；順鉑、阿霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別是（53.08±0.56）、（8.09±0.31）μg/mL，對(duì)siRNA-control A549/DDP細(xì)胞的IC50分別是（53.09±0.78）、（8.10±0.98）μg/mL，而對(duì)siRNA-NEK2 A549/DDP細(xì)胞的IC50有顯著下降，其值分別是（18.59±0.10）、（2.30±0.14）μg/mL，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論小分子NEK2干擾RNA沉默NEK2可以提高耐藥的肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。NEK2可能成為逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

肺癌；細(xì)胞耐藥；NEK2；siRNA-NEK2

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康，已成為世界上死亡率第一位的惡性腫瘤。約80%的患者就診時(shí)已屬晚期，化療成為其主要治療手段，而肺癌耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生是影響化療效果的重要原因。已有研究表明，腫瘤細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制極其復(fù)雜，除了進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度減少外，DNA斷裂修復(fù)加速、靶基因突變、擴(kuò)增、以及凋亡抑制蛋白的表達(dá)差異等均會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥[1]。因此，逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥的發(fā)生，已經(jīng)成為肺癌治療研究中的熱點(diǎn)。NEK2（NIMA-related kinase 2，NEK2）是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的NIMA相關(guān)激酶，屬于中心體相關(guān)蛋白激酶[2]。NEK2及其同系物過(guò)表達(dá)可以聚集中心體而過(guò)快推進(jìn)有絲分裂進(jìn)程甚至直接觸發(fā)染色質(zhì)的分裂[3]。近年來(lái)的研究已發(fā)現(xiàn)，NEK2廣泛高表達(dá)于多種腫瘤，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[4]；NEK2基因的過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)將化療藥物泵出細(xì)胞外的蛋白質(zhì)的活性，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[5]。本研究擬從沉默NEK2基因入手，探討耐藥的肺癌細(xì)胞沉默NEK2基因后，化療藥物敏感性的變化，為臨床肺癌化療耐藥逆轉(zhuǎn)，提高化療療效尋找新的靶點(diǎn)和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與細(xì)胞系

人肺腺癌敏感細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和耐順鉑（DDP）人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP細(xì)胞，均購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸病研究所。順鉑、阿霉素（江蘇豪森藥業(yè)有限公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Binder，德國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（Bio-Rad，美國(guó)），RNAiso plus kit、Prime-ScriptRRT reagent kit、LipofectamineTMRNAiMAX（Invitrogen，美國(guó)），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Boehringer Mannheim，德國(guó)），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Takara，大連），RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT、DMSO、TBST緩沖液、胎牛血清（FCS）（GIBCO BRL，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2、達(dá)到飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天以0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。A549/DDP細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行復(fù)蘇，培養(yǎng)2～3 d后待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用半量順鉑培養(yǎng)液（順鉑濃度：0.5 μg/mL）培養(yǎng)1夜，再以全量順鉑培養(yǎng)液（順鉑濃度：1 μg/mL）培養(yǎng)1夜，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.3 RNA的提取與RT-PCR

采用RNAiso plus kit試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒要求操作。NEK2上游引物序列：5'-CCACAGACGAAGTGATGGTG-3'，下游引物序列：5'-TGATTTTCCCAGCGAGTTCT-3'，檢測(cè)按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。定量PCR采用的體系為：dNTPs 2 μL，10×buffer 5 μL，上下游引物各10 pmol，Pfu酶0.5 μL，模板2 μL，加二蒸水至總體積50 μL；擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃5 min，進(jìn)入循環(huán)，變性94℃1 min，退火60℃1 min，延伸72℃3 min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參，依據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算各組細(xì)胞mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot法

將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后離心棄上清，加入含全酶抑制劑和苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液冰浴裂解提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，冰浴進(jìn)行電泳，電泳分離后用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加抗人NEK2多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，次日PBS 1次、TBST 2次洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。洗膜后ECL發(fā)光，X線片顯影、定影、掃描儀掃描膠片。

1.5 NEK2基因siRNA序列的設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染

siRNA片段由上海生工合成。靶向NEK2的siRNA序列為5'-CCAAGGAAAGGCAAUACUUUUdTdT-3'（sense）和5'-AAGUAUUGCCUUUCCUUGGUUdTdT-3'（antisense）。制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)組加入siRNA-NEK2混合物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。將人耐藥肺腺癌細(xì)胞A549/DDP以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，采用LipofetamineTM2000將siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.6 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)順鉑對(duì)沉默NEK2后A549/ DDP細(xì)胞增殖活性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分為4組即：A549細(xì)胞組（記為A549組）、A549/DDP組、A549/ DDP轉(zhuǎn)染Silencer Negative Control siRNA組（記為siRNA-Control A549/DDP組）及A549/DDP轉(zhuǎn)染siRNA-NEK2組（記為siRNA-NEK2 A549/DDP組）。細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的含藥培養(yǎng)基200 μL，每組濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不含細(xì)胞僅有培養(yǎng)基的空白組和含細(xì)胞不加藥物的陰性對(duì)照組。加藥完畢放入培養(yǎng)箱孵育24 h。取出培養(yǎng)板，每孔加20 μL MTT，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄上清，每孔加入150 μLDMSO，震蕩10 min使紫色結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔A值，記錄結(jié)果。計(jì)算各給藥濃度的抑制率，用SPSS 16.0求各藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）]×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEK2在A549細(xì)胞與A549/DDP細(xì)胞系中的表達(dá)

采用RT-PCR方法分析比較NEK2-mRNA在A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞系的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1A顯示，NEK2-mRNA在A549/DDP細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于A549細(xì)胞系。證明NEK2-mRNA在人耐藥非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞系中呈現(xiàn)出高表達(dá)，提示肺癌耐藥性與NEK2的表達(dá)差異性有關(guān)。采用Western blotting方法比較NEK2蛋白在A549細(xì)胞及A549/DDP的差異表達(dá)。結(jié)果如圖1B所示，NEK2蛋白在A549/DDP中的表達(dá)水平明顯高于A549細(xì)胞，與基因水平結(jié)果一致，提示NEK2蛋白高表達(dá)與肺癌細(xì)胞的耐藥有關(guān)。

圖1 NEK2在A549及A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2 siRNA-NEK2沉默效果鑒定

采用RT-PCR及Western blot檢測(cè)siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后的沉默效果。siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞24、48 h后，與對(duì)照組相比，NEK2 mNRA及蛋白表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 siRNA-NEK2轉(zhuǎn)染效果圖

2.3 順鉑及阿霉素對(duì)沉默NEK2后A549/DDP細(xì)胞增殖活性的影響

采用脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，將NEK2小片段RNA導(dǎo)入A549/DDP細(xì)胞沉默NEK2基因，并用MTT法檢測(cè)順鉑及阿霉素對(duì)A549以及沉默NEK2前后A549/ DDP細(xì)胞的增殖抑制活性。沉默NEK2基因后，順鉑及阿霉素對(duì)siRNA-NEK2 A549/DDP組的增殖抑制活性較A549/DDP組、siRNA-control A549/DDP組明顯增加，IC50明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明沉默NEK2可以增加化療藥物對(duì)肺癌細(xì)胞的敏感性。見(jiàn)圖3、表1。

圖3 順鉑及阿霉素對(duì)細(xì)胞的增殖抑制曲線

表1 順鉑及阿霉素對(duì)細(xì)胞半數(shù)抑制濃度影響（μg/mL，x±s）

3 討論

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是化療藥物在臨床應(yīng)用時(shí)的常見(jiàn)阻礙，它會(huì)導(dǎo)致化療的失敗，與患者治療效果不佳有關(guān)，包括癌癥的復(fù)發(fā)和患者的死亡[6]。因此，研究耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制并尋找應(yīng)對(duì)方法，是提高化療藥物臨床有效性的迫切需要。NEK2屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶，集中于染色體著絲，粒通過(guò)底物磷酸化調(diào)節(jié)紡錘體的形成和分離，影響細(xì)胞有絲分裂從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖[7]。研究發(fā)現(xiàn)，NEK2基因與增加癌癥抗藥性、加速癌癥生長(zhǎng)以及患者死亡率上升存在很強(qiáng)的相關(guān)性。在2500例患者中，NEK2基因表達(dá)的增加均與患者的快速死亡有關(guān)[5]。對(duì)乳腺癌MDA-MB-231和MDAMB-468細(xì)胞耐藥機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，NEK2干擾siRNA可以改善癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[8]。本研究經(jīng)RT-PCR法及Western blot法證明了耐藥的肺癌細(xì)胞A549/DDP細(xì)胞NEK2-mRNA、NEK2蛋白表達(dá)水平顯著高于A549細(xì)胞，說(shuō)明NEK2與肺癌細(xì)胞耐藥有關(guān)。

前期研究發(fā)現(xiàn)耐藥的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549高表達(dá)NEK2，本研究采用siRNA抑制細(xì)胞表達(dá)NEK2，觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)變化。研究通過(guò)MTT法發(fā)現(xiàn)抑制NEK2表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，推測(cè)與NEK2的微管調(diào)控作用相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，NEK2與腫瘤細(xì)胞中染色質(zhì)不穩(wěn)定性相關(guān)[9]。在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，染色質(zhì)的分離是一個(gè)依賴于微管活動(dòng)的復(fù)雜過(guò)程，微管形成紡錘體后，引起細(xì)胞分裂。NEK2在中心體的定位依賴于其C端調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的有絲分裂，此定位也是微管結(jié)合所必需的[10]。抑制NEK2能阻礙中心體的成熟和紡錘體相關(guān)蛋白的招募[11]；所以總的來(lái)說(shuō)，NEK2不僅是中心體分裂間期一個(gè)關(guān)鍵的組件，而且還是中心體自身裝配及檢修所必需的。研究表明，沉默NEK2后，TNBC細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性增加，并且使TNBC細(xì)胞凋亡增加，可能是由于有絲分裂的異常[12]。

本研究通過(guò)小分子NEK2干擾RNA，并經(jīng)MTT法觀察順鉑、阿霉素對(duì)沉默NEK2后A549/DDP細(xì)胞增殖抑制活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑及阿霉素對(duì)siRNA-NEK2 A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制活性與對(duì)照組（A549/DDP、siRNA-control A549/DDP）相比明顯增加，IC50明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加，說(shuō)明沉默NEK2可以提高耐藥肺癌細(xì)胞A549/DDP對(duì)相關(guān)化療藥物的敏感性，使得肺癌細(xì)胞耐藥得到逆轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌的耐藥性和抗凋亡因子NEK2的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)；小分子NEK2干擾RNA沉默NEK2基因能夠提高耐藥肺癌細(xì)胞對(duì)相關(guān)化療藥物的敏感性，肺癌細(xì)胞耐藥得以逆轉(zhuǎn)；NEK2可以成為逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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Study of drug-resistant effect on lung cancer cells with siRNA-NEK2 silencing

CHEN Yongfeng1,2WANG Haijing1LIU Dingyuan1ZHOU Xiangdong11.Department of Respiratory,Southwest Hospital of the Third Military Medical University,Chongqing400038,China; 2.Department of Reception,the 75600 Army Hospital of PLA,Guangdong Province,Shenzhen518048,China

Objective To investigate the drug-resistant effect of siRNA-NEK2 on lung cancer cells lines A549/DDP. Methods Expression of NEK2-mRNA and NEK2-protein was examined in human A549 cells and A549/DDP cells by Real-time PCR and Western blot.The changes of cytotoxic activity were observed on the A549/DDP cells of silence NEK2 by MTT assay.Results The expression of NEK2-mRNA and NEK2 protein were higher in A549/DDP cells than A549 cells(P＜0.05).After treatment with DDP and Epirubicin,the IC50values of A549/DDP cells were(53.08±0.56) and(8.09±0.31)μg/mL respectively,and the IC50values of siRNA-control A549/DDP cells were(53.09±0.78)and (8.10±0.98)μg/mL respectively.While the IC50values were significantly decreased in siRNA-NEK2 A549/DDP cells [(18.59±0.10),(2.30±0.14)μg/mL],two groups were compared,the differences were statistically significant(P＜0.05). Conclusion Silence NEK2 with interfering RNA molecule can reduce the resistance of lung cancer cells with resistant and may increase the sensitivity of chemotherapy-resistant lung cancer patients.Therefore,NEK2 may be a new target that reverses the drug resistance of lung cancer.

Lung cancer;Drug resistance;NEK2;siRNA-NEK2

R563.9

A

1673-7210（2014）02（b）-0017-04

2013-09-06本文編輯：李繼翔）

陳永鋒（1972.6-），男，博士；研究方向：肺癌的耐藥的臨床與基礎(chǔ)。

周向東（1963.10-），男，博士，博士研究生導(dǎo)師，第二軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院呼吸科主任；研究方向：肺癌及肺癌的耐藥的基礎(chǔ)與臨床。