羅霞　周景喜　陳華志

[摘要] 目的 探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在口腔白斑血管生成中的作用及其與口腔白斑術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性與影響因素。 方法 免疫組化法檢測口腔鱗狀細胞癌、口腔白斑及口腔正常黏膜中HIF-1α的表達情況，熒光定量PCR法檢測microRNA表達。 結(jié)果 與口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相對表達量顯著增加，而口腔鱗癌與口腔白斑相比，microRNA相對表達量顯著增加，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 HIF-1α在口腔白斑及白斑癌組織中過度表達，其可作為判斷口腔黏膜組織發(fā)生白斑病變及白斑癌變的標志物之一。

[關(guān)鍵詞] 缺氧誘導(dǎo)因子-1α；口腔白斑；血管生成

[中圖分類號] R739.8 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）05-0028-03

我國口腔頜面部鱗狀細胞癌多發(fā)于40～60歲的成年人，早期發(fā)現(xiàn)是目前預(yù)防與治療鱗癌的最佳方法，通過HIF-1α與口腔白斑癌變的相關(guān)性研究可以早期判斷白斑的性質(zhì)?？谇火つぐ装呤强谇火つげ≈谐Ｒ姷囊环N疾病，國內(nèi)外一直有大量學(xué)者在研究兩者的關(guān)系，探討HIF-1α在口腔黏膜白斑可能的相關(guān)發(fā)病機制，為口腔黏膜白斑的診斷、治療和預(yù)后判斷提供實驗依據(jù)[1]。本研究將采用免疫組化法測定口腔白斑組織中HIF-1α表達情況，并對其與口腔白斑發(fā)生及發(fā)展相關(guān)性進行分析，旨在為臨床口腔白斑的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2005～2012年從本院病理科選取的口腔鱗狀細胞癌、口腔白斑及口腔正常黏膜石蠟切片標本各15例，三組病理組織學(xué)標本結(jié)果均由兩位資深的病理分析醫(yī)師共同確認。每個樣本均采用連續(xù)切片法，樣本的厚度為4 μm，具體資料見表1。

表1 實驗樣本基本資料

1.2 方法

1.2.1 microRNA含量的測定 采用RT-PCR（購于美國ADI公司）測定各組組織中microRNA含量，設(shè)計針對人microRNA的PCR探針序列以及熒光檢測引物，選擇人GAPDH（由美國BD公司提供）作為測試的內(nèi)參物，并采用Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）提取RNA，熒光定量PCR實驗嚴格按照試劑盒操作說明進行。microRNA相對表達量=目的基因/內(nèi)參基因。

1.2.2 免疫組化法測定 采用免疫熒光組化法檢測兩組HIF-1α、VEGF表達情況，兔抗人VEGF多克隆抗體購于福州邁新生物技術(shù)公司，HIF-1α鼠抗人多克隆抗體購于北京金橋生物技術(shù)公司。HIF-1α采用EDTA熱修復(fù)處理20 min，VEGF采用檸檬酸緩沖液于高壓鍋中熱修復(fù)處理2 min后采用冷水洗滌，并采用PBS緩沖液對樣品進行沖洗，經(jīng)蘇木精復(fù)染后采用乙醇對樣本脫水并制成中性樹膠封片，并與已知的陽性切片進行對比，陰性對照采用PBS緩沖液替代一抗的樣本為參照。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷

①HIF-1α陽性表達為棕黃色顆粒見于細胞核內(nèi)，VEGF陽性表達為棕黃色顆粒見于細胞質(zhì)及細胞核內(nèi)。②在倍數(shù)為100的顯微鏡下觀察細胞著色情況，根據(jù)著色程度由輕至重可分別計為0、1、2、3分。隨機選取5個視野點，采用倍數(shù)為400的顯微鏡進行觀察，每個視野進行細胞計數(shù)，以500個細胞作為一組計算單位，細胞陽性百分率：1分為<10%，2分為10%～50%，3分為>50%。積分計算：①與②計算所得的分值相乘。0分為陰性“-”，1～3分為弱陽性“+”，4～6分為中度陽性“++”，7～9分為強陽性“+++”[3]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗，HIF-1α與VEGF相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，P < 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 microRNA的相對表達量分析

與口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相對表達量顯著增加，而口腔鱗癌與口腔白斑相比，microRNA相對表達量顯著增加，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 HIF-1α與VEGF陽性表達情況

正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中HIF-1α陽性表達率分別為0、73.30%、100.00%，而正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中VEGF陽性表達率分別為0、66.70%、100.00%。見表3。

表3 HIF-1α與VEGF陽性表達情況

注：與對正常黏膜相比，口腔白斑χ2=5.487，aP < 0.05；與口腔白斑相比，χ2=4.212，bP < 0.05

2.3 microRNA與HIF-1α、VEGF相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析可知，microRNA與HIF-1α表達呈負相關(guān)（r=-0.452，P=0.000），與VEGF蛋白呈正相關(guān)（r=0.378，P=0.000）。

3 討論

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是口腔科中常見的惡性腫瘤，其臨床發(fā)生率約占全身惡性腫瘤發(fā)生率的3%～5%，約占口腔惡性腫瘤發(fā)生率的90%以上[2]。OSCC在我國是口腔頜面部中常見的惡性腫瘤，其臨床表現(xiàn)為早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤性強、預(yù)后差等特點，且該疾病容易轉(zhuǎn)化為萎縮型、長期糜爛型以及潰瘍型[3]。由于OSCC屬于上皮源性腫瘤，因此其發(fā)生經(jīng)歷了與其他上皮細胞組織癌的發(fā)展過程相同，其發(fā)展過程經(jīng)歷了正常細胞到癌前病變最后發(fā)展成為轉(zhuǎn)移性癌癥等系列動態(tài)過程，其參與過程復(fù)雜、屬于多階段發(fā)生的過程，其病變過程是受到多種基因調(diào)控來完成。

目前普遍認為，口腔白斑復(fù)發(fā)是由于內(nèi)外因素共同作用引起的，血管生成是腫瘤發(fā)展的首要條件[4]。李德超等[5]認為，腫瘤周圍微環(huán)境中抑制因子及促進因子調(diào)控失衡是導(dǎo)致腫瘤血管生成的重要因素。VEGF是血管內(nèi)皮細胞有絲分裂素，屬于重要的血管生成促進因子，其在血管生成過程中處于核心地位[6]。大量研究表明[7]，在正常成年人群中VEGF的表達水平非常低，而在惡性腫瘤患者中VEGF表達水平異常高。此外，VEGF可誘導(dǎo)血管、淋巴管內(nèi)皮細胞遷移及增殖，促使淋巴血管及生成，并可增加淋巴血管通透性，加速淋巴血管轉(zhuǎn)移，因此與腫瘤惡性程度具有密切的關(guān)系。腫瘤患者體內(nèi)普遍存在免疫識別障礙的情況，機體在此情況下可將腫瘤組織誤認為自身組織，從而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，并誘導(dǎo)HIF-1α生成。HIF-1α表達增強可刺激腫瘤蛋白及基因轉(zhuǎn)錄，并促使VEGF大量生成。目前相關(guān)研究[8]表明，HIF-1α與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用。蔡勁等[9]研究指出，HIF-1α表達強度與癌癥患者總體生存期及術(shù)后復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)，HIF-1α表達水平可作為，口腔白斑患者根治手術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測指標。吳洋[10]對口腔白斑患者預(yù)后情況進行分析，其結(jié)果顯示口腔白斑患者己糖激酶-Ⅱ及HIF-1α表達強度與腫瘤大小、分化程度、臨床分期有密切關(guān)系，是影響患者術(shù)后預(yù)后的獨立危險因素。

本研究結(jié)果顯示，與口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相對表達量顯著增加，而口腔鱗癌與口腔白斑相比，microRNA相對表達量顯著增加，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)相關(guān)性分析可知，microRNA與HIF-1α表達呈負相關(guān)（r=-0.452，P=0.000），與VEGF蛋白呈正相關(guān)（r=0.378，P=0.000），從而提示HIF-1α陽性表達強度與患者生存率及生存期限具有密切的關(guān)系。正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中HIF-1α陽性表達率分別為0、73.30%、100.00%，而正常黏膜、口腔白斑、口腔鱗癌中VEGF陽性表達率分別為0、66.70%、100.00%，從而提示通過測定口腔白斑患者HIF-1α陽性表達情況，對預(yù)測患者病情進展具有重要的意義。HIF-1α在口腔白斑及白斑癌組織中過度表達，其可作為判斷口腔黏膜組織發(fā)生白斑病變及白斑癌變的標志物之一。

[參考文獻]

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[9] 蔡勁，任大宏，楊靜，等. 舌鱗癌組織中HIF-1α和VEGF表達及與腫瘤血管生成的關(guān)系[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志，2013， 29（8）：1215-1218.

[10] 吳洋. HIF-1α/VEGF信號通路對口腔癌生物學(xué)行為影響及診療意義[J]. 中國實用口腔科雜志，2012，5（12）：713-720.

（收稿日期：2013-11-01）