黃德滿(mǎn),尹哲進(jìn),文成規(guī),尹學(xué)峰,王澤港

(1.金日成綜合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，平壤 99903；2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

褐藻糖膠(fucoidan,FUC)是一類(lèi)主要由巖藻糖及硫酸酯基團(tuán)組成的多糖類(lèi)物質(zhì),廣泛存在于褐藻及一些海洋無(wú)脊椎動(dòng)物(如海參,海膽等)體內(nèi)[1]。 含有豐富的免疫調(diào)節(jié)成分，具有類(lèi)似于肝素的多糖結(jié)構(gòu)，有較好的抗凝血活性，雖然其活性低于肝素，但由于肝素的副作用較大，因而仍具有較好的應(yīng)用前景。

過(guò)去幾十年間FUC得到了較為廣泛、系統(tǒng)的研究,己證實(shí)其具有多種生理活性,包括抗凝血與抗血栓、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血脂、抗氧化、抗補(bǔ)體特性、抗炎，還具有尿道、腎病、胃保護(hù)作用等[2-6]。但基于其結(jié)構(gòu)信息的構(gòu)效關(guān)系研究卻相對(duì)較少。

隨著生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的受體生物大分子的三維結(jié)構(gòu)被測(cè)定，可以用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)新的先導(dǎo)化合物[7-9]。

本試驗(yàn)應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，研究分析了動(dòng)物抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)變化特征。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件

數(shù)據(jù)庫(kù)：PIR(蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，http://pir.georgetown.edu/)，PDB(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，http://www.rcsb.org/pdb/)、CHARMM(Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics)的 PAR22(http://www.charmm.org/)。

軟件：多序列比對(duì)軟件 ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalW),分子模擬軟件ChemOffice Ultra7.0,HyperChem 7.03,VMD1.82，生物大分子分子動(dòng)力學(xué)并行計(jì)算軟件 Hyangsan[10]。

1.2 抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)仿真系統(tǒng)的構(gòu)建

利用HyperChem7.03，以抗凝血酶Ⅲ分子(從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB中獲得編號(hào)為1ANT的蛋白結(jié)構(gòu))為模型，模擬褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)模型。為了提供與生物體內(nèi)相似的水環(huán)境，用VMD1.82中的TIP3模型，生成水分子。

2 結(jié)果與分析

2.1 搜索抗凝血酶Ⅲ的肝素結(jié)合位點(diǎn)

褐藻糖膠與肝素在化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能上具有相似的特征，二者具有相同的抗凝血酶Ⅲ結(jié)合位點(diǎn)。在蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(PIR)中，以抗凝血酶Ⅲ的蛋白序列為搜索序列，用 “BLAST”程序進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，獲得相似性較高的抗凝血酶Ⅲ的蛋白質(zhì)序列，用于進(jìn)一步分析抗凝血酶Ⅲ的肝素結(jié)合位點(diǎn)。

用大分子結(jié)構(gòu)搜索程序Vast， 以抗凝血酶Ⅲ 1ANT(PDB序列號(hào))為標(biāo)準(zhǔn)序列來(lái)搜索結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB的同源序列，獲得高度同源序列1TB61、1ANTI、1ATH2、1ANTL、2ANTI、I59611、1ATTA、P41361、1ATT2、Q7M364。應(yīng)用多序列比對(duì)軟件CLUSTALW對(duì)這些同源蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，Arg13、Asn45、Arg46、Arg47、Glu113、Lys114、Lys125和Arg129是高度保守的肝素結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 抗凝血酶Ⅲ與褐藻糖膠結(jié)合后抗凝血酶Ⅲ的結(jié)構(gòu)變化

觀察模擬過(guò)程中抗凝血酶Ⅲ—褐藻糖膠結(jié)構(gòu)的變化，其結(jié)構(gòu)變化時(shí)間持續(xù)了3.5 ns(圖1)。如圖1所示，2.2 ns后振動(dòng)狀態(tài)變成相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，而在抗凝血酶Ⅲ(不結(jié)合褐藻糖膠)的分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)中，120 ps后觀察到穩(wěn)定狀態(tài)，所用的時(shí)間是結(jié)合褐藻糖膠時(shí)所用時(shí)間的百分之二。比較抗凝血酶Ⅲ與抗凝血酶Ⅲ—褐藻糖膠復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)中心環(huán)(RCL)的變化最明顯(圖2)。

這表明抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠相結(jié)合后，抗凝血酶Ⅲ的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，即外源分子的結(jié)合會(huì)改變抗凝血酶Ⅲ的三維構(gòu)象。具體表現(xiàn)為結(jié)合后RCL更加外露，易于與其它反應(yīng)分子結(jié)合，從而增強(qiáng)抗凝血酶Ⅲ的反應(yīng)活性。

圖1 抗凝血酶Ⅲ與褐藻糖膠結(jié)合后抗凝血酶Ⅲ的均方根偏差(RMSD)的變化Fig.1 The RMSD change of antithromin Ⅲ combined with fucoidan

注：A代表抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合初期狀態(tài)；B代表抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合平衡狀態(tài)圖2 抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合時(shí)RCL的結(jié)構(gòu)變化Fig.2 The RCL change of antithrombin Ⅲ combined with fucoidan

2.3 抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合位點(diǎn)殘基的變化

褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合的時(shí)候，Lys28、Lys29、Ala43、Thr44，Ala383和Arg393的均方根偏差(RMSD)在0.150 nm以上(表1)。

表1 褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合時(shí)均方根偏差最高的殘基均方根偏差(RMSD)Table 1 The residues having great RMSD when fucoidan is bound to antithrombin Ⅲ

抗凝血酶Ⅲ中的Lys28、Lys29、Ala43、Thr44在褐藻糖膠的結(jié)合位點(diǎn)周?chē)?并且Lys28、Lys29、Ala43和Thr44周?chē)暮衷逄悄z的結(jié)合位點(diǎn)具有較高的RMSD值。Ala383和Arg393分別是抗凝血酶Ⅲ和凝血酶的結(jié)合位點(diǎn)，也就是形成RCL的殘基。這些殘基結(jié)合活性的增強(qiáng)是抗凝血酶Ⅲ與配體之間結(jié)合后產(chǎn)生的結(jié)果。

褐藻糖膠結(jié)合位點(diǎn)的8個(gè)殘基中有4個(gè)殘基(Arg13、 Arg46、Arg47、Glu113)的RMSD較平均RMSD(0.049 nm)高，而另外4個(gè)殘基比平均RMSD的值低(表2)。

表2 抗凝血酶Ⅲ的肝素結(jié)合位點(diǎn)殘基的均方根偏差(RMSD)Table 2 RMSD of the residues at the binding site of antithrombin Ⅲ to heparin

注：A代表抗凝血酶; B代表抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合;C代表抗凝血酶Ⅲ和肝素結(jié)合圖3 抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合時(shí)Arg393的位置變化Fig.3 The various states of Arg393 in some sorts of antithrombin Ⅲ combined with fucoidan

這表明，抗凝血酶Ⅲ中的褐藻糖膠的結(jié)合位點(diǎn)是相對(duì)固定的。但是當(dāng)褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，引起靠近褐藻糖膠的殘基的均方根偏差(RMSD)增高，并導(dǎo)致Lys28與Thr44之間的部分出現(xiàn)了較大的變化。無(wú)論褐藻糖膠結(jié)合與否，凝血酶Ⅲ內(nèi)RCL部分,Ala383和Arg393的RMSD比較高，與其它部分相比具有較高的結(jié)合活性。另一方面，褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物的所有原子的平均RMSD是0.208 nm,其中RCL中的Cα原子的平均RMSD是0.074 nm，這表明除Cα外其它原子的空間位置變化都很大。模擬結(jié)果表明，抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠結(jié)合時(shí)Arg393從抗凝血酶Ⅲ的內(nèi)部激發(fā)到了復(fù)合物結(jié)構(gòu)的表面(圖3)。當(dāng)被褐藻糖膠激活的抗凝血酶Ⅲ和凝血酶結(jié)合時(shí)，抗凝血酶Ⅲ的Arg393與凝血酶的活性中心殘基Asp、His、Ser結(jié)合，并進(jìn)入到四面體的過(guò)渡狀態(tài)。

抗凝血酶Ⅲ和凝血酶的復(fù)合物與抗凝血酶Ⅲ和褐藻糖膠的復(fù)合物進(jìn)行比較，Cα原子的平均RMSD值是0.024 nm,RCL的RMSD 平均值是0.017 nm，二者比較接近。這表明，褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物的結(jié)構(gòu)是有利于結(jié)合凝血酶的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 語(yǔ)

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法,在新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化中起重要的作用。理論計(jì)算和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法可以研究生物大分子上藥物結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),配體與受體復(fù)合物的構(gòu)型與立體化學(xué)特征,結(jié)合模式和選擇性等等,可為改進(jìn)現(xiàn)有的生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)新的化合物,提供理論上的指導(dǎo)和思路[11-12]。

褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ結(jié)合的時(shí)候，反應(yīng)中心環(huán)(RCL)的變化最明顯，褐藻糖膠和抗凝血酶Ⅲ的結(jié)合使抗凝血酶Ⅲ從非活性狀態(tài)變?yōu)榱嘶钚誀顟B(tài)，從而更容易與凝血酶結(jié)合。

本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)方法，分析了褐藻糖膠與抗凝血酶Ⅲ的作用機(jī)制，研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)新藥提供了有重要參考價(jià)值的理論依據(jù)。

[1] Bilan M I,Usov A I.Structural Analysis of Fucoidans[J].Natural Product Communications,2008(10):1639-1648

[2] 王君，胡霞敏.海藻提取物Fucoidan抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(7):1757-1758

[3] 朱良，張杰平.繁枝蜈蚣藻多糖對(duì)小鼠抗疲勞和耐缺氧作用研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2009,10:41-43

[4] 宋云端，秦維超，呂濤，等.半葉馬尾藻多糖對(duì)輻射損傷小鼠免疫功能的保護(hù)作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(8):1956-1958

[5] 盛玉青，尹鴻萍，李海濤.螺旋藻多糖硫酸酷化修飾前后抗腫瘤及免疫活性的研究[J].藥物生物技術(shù),2006,13(2):4-6

[6] Koyanagi S,Tangnigawa N,Nakagawa H,et al.Oversulfation of Fucoidan Enhances its Anti-angiogenic and Antitumor Activities[J].Biochemical Pharmacology,2003,65(2):173-179

[7] Digabriele A D,Chen D I.Structure of a Heparin-linked Biologically Active Dimer of Fibroblast Growth Factor[J].Nature,1998,393(16):812-817

[8] S Faham,R E Hileman,J R Fromm,et al.Crystallographic Analyses of Heparin Oligosaccharides Binding to Basic Fibroblast Growth Factor[J].Science,1996,271:1116-1120

[9] 文志紅，鄔素華，陳維濤.醫(yī)用肝素化抗凝血高分子材料的研究進(jìn)展[J].塑料,2005,34(2):26-30

[10] Dok man Hwang,Chol man Han.The Development of Molecular Dynamics Paratactic Calculation Software,Hyangsan[J].Journal of Kim Il Sung University:Natural science,2006,52(3):106-111

[11] 高寧國(guó)，程秀蘭，楊敬，等.肝素結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展,1999,19(5):4-13

[12] Li W,Johnson D J D,Esmon C T,et al.Structure of the Antithrombin-thrombin-heparin Ternary Complex Reveals the Antithrombotic Mechanism of Heparin[J].Nature Structural & Molecular Biology,2004(11):857-862