曾 丹 綜述,周維康 審校

(重慶市第三人民醫(yī)院過敏反應(yīng)科 400014)

梅毒是由蒼白螺旋體(treponema pallidum，TP)引起的慢性傳染病，主要通過性交傳染。近年來，世界各地梅毒發(fā)病率呈上升趨勢，我國梅毒發(fā)患者數(shù)也快速增長，據(jù)報(bào)道，2010年全國報(bào)告梅毒病例358 534例，2010年發(fā)病率26.86/10萬，比2009年增加17.02%，居全國乙類傳染病的第3位。本病危害大，可侵犯皮膚黏膜、心血管、神經(jīng)、骨骼等造成多系統(tǒng)損害,也可使妊娠期婦女發(fā)生流產(chǎn)、死胎和分娩先天梅毒兒。在性傳播疾病中，梅毒致死性僅次于艾滋病，其與艾滋病的傳播途徑相似，同時(shí)，梅毒作為一種潰瘍性性病，可大大增加感染HIV的風(fēng)險(xiǎn)，有報(bào)道稱生殖器潰瘍患者較健康人感染HIV的危險(xiǎn)性增加4～5倍[1]，因此，梅毒的流行在客觀上促進(jìn)了HIV的傳播，控制梅毒等相關(guān)的生殖器潰瘍疾病，能有效控制HIV的傳播和艾滋病的發(fā)生。目前，國內(nèi)外學(xué)者也越來越重視梅毒螺旋體的研究。梅毒螺旋體分子亞型研究不僅與梅毒流行病學(xué)緊密相關(guān)，也可用于識別和分析梅毒的再感染。TP不能根據(jù)血清學(xué)方法進(jìn)行區(qū)分，有學(xué)者曾通過DNA雜交及單核苷酸多態(tài)性等進(jìn)行分型，未成功[2-3]。自從Fraser等[4]揭示了TP的基因序列后，有關(guān)TP的研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。

1 TP基因分型系統(tǒng)

1.1arp、tprEGJ雙基因分型法(CDC分型系統(tǒng)) 最早進(jìn)行TP基因分型研究的是美國CDC的Pillay等[5]，其于1998年《Sex Transm Dis》中報(bào)道了一種分型方法，選用兩種顯示株內(nèi)變異的基因：酸性重復(fù)蛋白基因arp和TP重復(fù)序列tpr Ⅱ亞類(EGJ)作為分型基因，建立了TP基因的分型方法。將arp基因含有的60 bp(堿基對長度)相似重復(fù)序列的數(shù)目和tpr基因Mse1限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorohism,RFLP)的類型相結(jié)合。首先對arp基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，將得到的目的片段換算成60 bp重復(fù)序列的數(shù)目，并用相應(yīng)的阿拉伯?dāng)?shù)字表示。目前已發(fā)現(xiàn)arp含有2～22個(gè)60 bp重復(fù)基因序列，共21個(gè)亞型。Harper 等[6]的分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示在不同的人群、不同的臨床病程中,該重復(fù)序列的出現(xiàn)次數(shù)均存在顯著性差異。同時(shí)tpr基因進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物先后經(jīng)Mse1限制性酶切和瓊脂糖凝膠電泳分離，最后產(chǎn)生不同電泳條帶的樣式即為RFLP類型，依次用英文字母表示。根據(jù)不同株出現(xiàn)長度不等的限制性內(nèi)切酶的酶切片段，已發(fā)現(xiàn)tpr基因A-L共12個(gè)亞型。最后將兩個(gè)結(jié)果相結(jié)合即為TP基因型別,例如TP Nichols株屬于14a亞型。通過兔傳代并經(jīng)組織培養(yǎng)的TP Nichols株進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果和采用Simpson多樣性指數(shù)分析的結(jié)果均顯示，該分型方法具有結(jié)果穩(wěn)定、分辨率高和可重復(fù)性好的特點(diǎn)，容易操作，而且對TP株有很高的鑒別力，符合一般微生物分型系統(tǒng)的評判標(biāo)準(zhǔn)。

1.2arp、tpr/tp0548三基因分型法 最近，Marra等[7]在上述分型系統(tǒng)的基礎(chǔ)上引入了tp0548基因，進(jìn)一步提高了基因分析的區(qū)分能力。同樣的，是將arp基因含有的60 bp相似重復(fù)序列的數(shù)目和tpr基因Mse1 RFLP的類型相結(jié)合，再加上tp0548的基因分析。研究發(fā)現(xiàn)，從起始密碼子起，部分基因131 bp的下游側(cè)有變異，觀察到tp0548基因有9個(gè)不同的序列組，這些序列組用小寫英文字母a-i表示。將改進(jìn)了的分型系統(tǒng)表示為“CDC subtype/tp0548 sequence type”，例如：14d/f。這種分型系統(tǒng)被描述為“改良梅毒螺旋體菌株分型系統(tǒng)”，在接下來的研究中發(fā)現(xiàn)了這種分型系統(tǒng)具有生物學(xué)與臨床學(xué)的關(guān)聯(lián)性。通過對TP Nichols株與原始株的無性繁殖，然后進(jìn)行分型比較，結(jié)果二者的分型一致(14a/a)，提示該分型具有穩(wěn)定性的特點(diǎn)。國內(nèi)學(xué)者彭銳銳等[8]運(yùn)用了三基因定位分型方法檢測梅毒螺旋體基因型別的敏感性與特異性，分析arp基因60個(gè)堿基對重復(fù)序列的數(shù)目、tprEGJ基因MseI酶切后限制性片段長度多態(tài)性的型別和tp0548基因序列的型別，根據(jù)上述三基因的分析結(jié)果，分析梅毒螺旋體基因型別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床標(biāo)本中三個(gè)基因的擴(kuò)增敏感性分別是94.1%、91.2%和94.1%；91.2%的臨床標(biāo)本檢測出完整的基因型別，與二基因分型法相比，提高了6.2%的區(qū)分度?？梢哉J(rèn)為，改良的三基因分型方法檢測梅毒螺旋體基因型別具有敏感性高、特異性好、區(qū)分度強(qiáng)的特點(diǎn)。

2 梅毒螺旋體基因分型的臨床應(yīng)用

2.1基因分型標(biāo)本的選取 目前用于分型的標(biāo)本主要考慮梅毒螺旋體的量，主要來源于早期梅毒的侵潤性皮損，且主要是潰瘍性皮損，也有腦脊液和全血。Martin等[9]認(rèn)為，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測一期梅毒患者體內(nèi)梅毒螺旋體DNA最適合的標(biāo)本是生殖器潰瘍分泌物。一些研究者發(fā)現(xiàn)以血清為標(biāo)本，陽性率高，另外有報(bào)道以血漿為樣本，陽性率高[10-11]，而Orton等[12]稱在全血中未能檢測到梅毒螺旋體。Molepo等[13]在對梅毒患者腦脊液(CSF)標(biāo)本進(jìn)行分型分析時(shí)發(fā)現(xiàn),性病研究實(shí)驗(yàn)室(VDRL)陽性的CSF標(biāo)本,可能有足夠的DNA以供分型研究，因?yàn)樵谒锌煞中偷臉?biāo)本中，僅一份標(biāo)本其VDRL試驗(yàn)的IgG結(jié)果陰性，其余均為陽性。Castro等[11，14]研究發(fā)現(xiàn)耳垂血用于PCR檢測的效率高于全血、血漿和血清,其原因可能是TP與包柔氏螺旋體相似,多隱藏于毛細(xì)血管床比較豐富的耳垂部。還有最近的一項(xiàng)研究，Wu等[15]發(fā)現(xiàn)，TP DNA分離率最高的是潰瘍分泌物，接下來依次是血漿、血清、腦脊液和玻璃體液。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能是由于梅毒螺旋體DNA提取方法、PCR檢測技術(shù)以及臨床樣品的質(zhì)量和梅毒螺旋體含量等一些不避免的因素造成。另外，其他臨床樣本也可用于梅毒螺旋體的PCR技術(shù)檢測，如二期梅毒疹滲出物、淋巴結(jié)穿刺液、羊水、組織抽吸物、石蠟包埋組織、精液、外周血單核細(xì)胞、胃黏膜組織、樹膠腫等。

2.2梅毒螺旋體基因分型用于流行病學(xué)調(diào)查

2.2.1arp、tpr雙基因分型法(CDC分型系統(tǒng))的應(yīng)用 梅毒螺旋體的arp基因和tpr基因的聯(lián)合分型目前主要用于梅毒分子流行病學(xué)調(diào)查。Pillay等[5]首次應(yīng)用這種分型方法,將在美國、馬達(dá)加斯加和南非收集的46例樣本分16個(gè)亞型,其中馬達(dá)加斯加收集的21個(gè)樣本有12個(gè)屬于14d亞型,美國收集的13個(gè)樣本只有3個(gè)屬于14d亞型,從這可以反映出14d亞型在馬達(dá)加斯加廣泛流行。另有研究發(fā)現(xiàn)南非各地區(qū)的161例樣本可分35個(gè)亞型,優(yōu)勢流行菌株亦14d亞型，研究人員推測,菌株高度的變異性可能是梅毒在南非長期流行的結(jié)果[16]。而在亞利桑那州、卡羅來納州和美國北部,14F亞型是主要的流行株[16]。南非比勒陀利亞[13],研究者們從來源于晚期神經(jīng)梅毒患者的標(biāo)本中，確定了4種不同類型，分別是14A、2I、3E、17E，14A亞型是比勒陀利亞神經(jīng)梅毒最主要的流行株,接下來為3E，并檢出少見的亞型(2I和 17E),其中2I、3E、17E是在那之前的研究中所沒有的，tpr中的e和i限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)曾經(jīng)報(bào)道過，但只有兩個(gè)或三個(gè)60 bp重復(fù)序列的arp是首次報(bào)道。這個(gè)研究發(fā)現(xiàn)了4個(gè)亞型，提示沒有某一亞型與神經(jīng)梅毒的存在有獨(dú)特的聯(lián)系，所以進(jìn)一步的研究是必要的，用以確定哪一種TP菌株類型與梅毒的不同臨床表現(xiàn)有關(guān)聯(lián)。葡萄牙里斯本的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[17]，在同一患者所有樣品中有相同的亞型，已經(jīng)可以確定5種分子亞型(亞型10a、14a、14c、14f、14g),其中最常見的14a和最不常發(fā)現(xiàn)的10a，據(jù)研究表明，這是第一次確定10a亞型。而在蘇格蘭地區(qū)[18]，從來自白種男同性戀患者的75分標(biāo)本中檢測螺旋體DNA，一共確定了6種亞型(14b、14d、14e、14k、14j、14p)，最常見的為14d，接下來為14e、14j、14b、14p、14k，這一研究表明，14d在蘇格蘭地區(qū)占主導(dǎo)，同時(shí)，也表明了在蘇格蘭男同性戀有驚人的遺傳多樣性水平。而里斯本最常見的14a卻沒有在蘇格蘭地區(qū)發(fā)現(xiàn)，沒有證據(jù)表明14d這一亞型與任何特定的患者、人口特征和地點(diǎn)有聯(lián)系，但不能排除有相關(guān)特定流行病學(xué)、人口或危險(xiǎn)因素的其他亞型。Cole等[19]在哥倫比亞做了一項(xiàng)關(guān)于二期梅毒的研究，用實(shí)時(shí)定量PCR確定了4種基因亞型，分別是14d、16d、13d和22a，同時(shí)這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)第一次定量證實(shí)了有著顯著比例的未經(jīng)治療的二期梅毒患者體內(nèi)存在相當(dāng)數(shù)量的循環(huán)螺旋體。至于TP是如何能長期存在于梅毒患者體內(nèi)，還需要進(jìn)一步的研究。在澳大利亞的一項(xiàng)男同性戀梅毒患者研究中[20]，確定了11種亞型(14e、14d、14k、14p、14i、14b、14l、12i、13b、13i、13e)。與其他地區(qū)比起來，澳大利亞的TP亞型沒有明顯的不同,最常見的是14e型。該試驗(yàn)也試圖研究TP亞型與HIV感染、地域分布及梅毒不同臨床表現(xiàn)的關(guān)系，遺憾的是，沒有找到它們之間的任何聯(lián)系。

2.2.2arp、tpEGJ/tp0548三基因分型法的應(yīng)用 Marra等[7]在雙基因分型的基礎(chǔ)上率先嘗試并且開創(chuàng)了三基因分型系統(tǒng)，來自美國、中國、愛爾蘭、馬達(dá)加斯加島等的173份標(biāo)本，用三基因分型法可以得到25種菌株類型，而二基因分型法只能得到14種，更重要的發(fā)現(xiàn)是，含有14個(gè)酸性重復(fù)蛋白基因的三個(gè)亞型(14a、14d、14e)可以進(jìn)一步分離成單獨(dú)的9個(gè)型別，亞型10d、11d、12a和15d也可以用三基因分型系統(tǒng)再進(jìn)行細(xì)分，這證實(shí)了三基因分型法更好的基因區(qū)分能力，同時(shí)，該研究發(fā)現(xiàn)最常見的基因分型是14d/f、14d/g和15d/f。國內(nèi)學(xué)者在《Sex Transm Infect》報(bào)道了我國TP的分型情況[21]，這項(xiàng)研究地區(qū)范圍包括我國東部(南京)、南部(廣州、江門、福州)、西南部(南寧、成都)、北部(天津)、東北部(哈爾濱)，一共確定了27種TP亞型，總的來說，我國TP亞型的分布在地理區(qū)域上有著顯著的不同，但是以14d/f最為常見，接下來分別是15d/f、13d/f、16d/f、14a/f。雖然梅毒螺旋體在我國表現(xiàn)出遺傳多樣性，但是14d/f優(yōu)勢亞型可能暗含著梅毒跨地域傳播的可能性。來自英國倫敦的學(xué)者Tipple等[22]在對抵抗大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的梅毒螺旋體研究中發(fā)現(xiàn)倫敦地區(qū)有兩種亞型分布14d/g、14d/f，其中14d/g為主要的類型，而tp0548基因的g型可能與大環(huán)內(nèi)酯抵抗有關(guān)。Wu等[15]也用三基因分型系統(tǒng)檢測了136個(gè)梅毒患者，檢測出來的亞型分別為14f/f、14f/c、14b/c、14k/f、9f/f、10b/a，其中最常見的為14f/f，而9f/f、10b/a是發(fā)現(xiàn)的新的基因型別，為首次報(bào)道，這些提示目前在臺灣地區(qū)流行的梅毒螺旋體可能不同于美國和我國其他地區(qū)的型別。

綜合世界各地的梅毒分型研究結(jié)果，梅毒亞型分布具有一定的特點(diǎn)，多個(gè)亞型或菌株型在同一地區(qū)共存和同一菌株在多地區(qū)出現(xiàn)的現(xiàn)象，表現(xiàn)出了遺傳變異的復(fù)雜性及亞型分布的多樣性。見表1。

表1 不同國家、地區(qū)梅毒亞型分布統(tǒng)計(jì)

續(xù)表1 不同國家、地區(qū)梅毒亞型分布統(tǒng)計(jì)

2.3分子亞型與臨床聯(lián)系 有研究發(fā)現(xiàn)，在兔模型中，不同的梅毒螺旋體菌株感染其病程和臨床表現(xiàn)有所不同，某些菌株是神經(jīng)梅毒的易感菌株，這些發(fā)現(xiàn)對梅毒的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。相關(guān)研究提示，14 d/f可能與神經(jīng)梅毒的易感性相關(guān)[7]，或者14d/f的TP菌株更能逃逸宿主免疫的應(yīng)答。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[15]，感染14f/f的梅毒患者更可能表現(xiàn)出一期梅毒，可能的解釋為14f/f可使?jié)儽憩F(xiàn)的更明顯或者持續(xù)的時(shí)間更長，使得患者和臨床醫(yī)師容易發(fā)現(xiàn)，還有種推測是14f/f型別的菌株在棉簽拭子標(biāo)本中或者在運(yùn)輸過程中能更好地適應(yīng)環(huán)境而存活下來，而14f/f的二期梅毒患者在青霉素治療的過程中更易發(fā)生吉海爾反應(yīng)，至于導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因，尚不清楚。國外有專家認(rèn)為，TP tpr基因家族是引起梅毒的主要的致病因子，是宿主體液免疫和細(xì)胞免疫的主要靶基因，這些蛋白可能在梅毒感染的免疫反應(yīng)和保護(hù)性免疫中起著重要作用[23]。臨床上部分梅毒患者出現(xiàn)“血清固定”現(xiàn)象，Giacani等[24]做梅毒血清固定與梅毒螺旋體tpr基因亞型關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)血清固定的形成可能與TP tpr基因的i亞型相關(guān)。

3 展 望

雖然梅毒的有效治療方法已在臨床運(yùn)用了幾十年，但梅毒仍然是一個(gè)嚴(yán)重危害群眾身心健康的重大公共健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界每年新發(fā)梅毒數(shù)可達(dá)1 200萬例。分子流行病學(xué)被證明在預(yù)防和控制一定的傳染性疾病方面是有用的，例如，結(jié)核分子桿菌的基因分型能將常規(guī)公共衛(wèi)生調(diào)查所不能發(fā)現(xiàn)的患者確定出來，以脈沖凝膠電泳為基礎(chǔ)的分子分型已能加強(qiáng)食源性疾病傳染的監(jiān)督，同樣的，分子流行病學(xué)還是應(yīng)該常規(guī)用于性傳播疾病的預(yù)防和控制，雖然這些方法已用于淋病的研究[25]。梅毒分子亞型的研究將繼續(xù)遵循：(1)新亞型的確定；(2)爆發(fā)株的檢測；(3)鑒定各種特殊亞型之間的聯(lián)系及其毒力和疾病的轉(zhuǎn)歸；(4)梅毒分子亞型的研究也將決定是否可消除地方特有的菌株水平的策略[18]。不像其他的性傳播疾病，梅毒有較長的潛伏期，早期的臨床表現(xiàn)不明顯，所有的這些因素導(dǎo)致了其流行病學(xué)研究的困難，盡管有這些挑戰(zhàn)，但TP分型系統(tǒng)已經(jīng)能夠解決一些問題，進(jìn)一步的分子流行病學(xué)的研究和更好地方法有待于挖掘，從而能更好地服務(wù)于臨床，解決梅毒患者之疾苦。

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