宗海斌，黃媛霞,董玉珍△,周慧聰

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外科，河南衛(wèi)輝 453100)

周圍神經(jīng)損傷后肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致不可逆性失神經(jīng)肌萎縮，在神經(jīng)恢復(fù)前有效地抑制細(xì)胞的凋亡減緩肌萎縮，一直是中樞、周圍神經(jīng)損傷治療的一個(gè)重要方面[1]。許多學(xué)者認(rèn)為周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌減少，給予外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin 3，NT-3)對促進(jìn)神經(jīng)再生及保護(hù)肌萎縮均有作用[2]，但其作用機(jī)制卻不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用NT-3治療大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型,通過觀察治療后其對caspase-3基因、肌細(xì)胞凋亡、Ca2+-ATP酶等指標(biāo)的影響,來探討NT-3 對神經(jīng)損傷修復(fù)和肌萎縮的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 Wistar 成年大鼠60只由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，雌雄不拘,體質(zhì)量200～250 g；S-100免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞蛋白提取、凋亡細(xì)胞試劑盒均由湖北武漢博士德生物工程有限公司提供；NT-3 質(zhì)粒由北京塞百盛生物工程有限公司合成提純。恒溫培育箱、離心機(jī)、冰凍切片機(jī)購自德國Leica公司；分子生物學(xué)凝膠電泳儀購自美國Sigma公司；TJTY-300圖像分析軟件及光鏡購自日本Philips 公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型制作、分組 健康Wistar大鼠60只，2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉(30 mg/kg)，在16倍顯微鏡下暴露坐骨神經(jīng)，距坐骨神經(jīng)出口下2 cm處切斷，近端返折縫合到附近肌肉當(dāng)中，遠(yuǎn)斷端用10-0顯微縫線結(jié)扎，建立坐骨神經(jīng)損傷動(dòng)物模型。分組后使用微量注射器腓腸肌內(nèi)分別注射生理鹽水和NT-3基因2 μL(濃度為1 μg/μL)，注射后留針2 min，術(shù)后所有動(dòng)物按常規(guī)分籠飼養(yǎng)。

1.2.2測定caspase-3蛋白表達(dá) 于術(shù)后2 h、4 h、8 h、1 d、3 d、7 d、14 d和21 d麻醉下抽取腓腸肌總RNA，采用細(xì)胞蛋白提取試劑盒(將肌細(xì)胞內(nèi)的caspase-3蛋白完全提取)進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系(取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)的條件，加入Taq聚合酶0.5 μL，內(nèi)參照(actin)引物3 μL，先將樣品于94 ℃變性5 min，按下列參數(shù)循環(huán)35次：94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min,55 ℃延伸1 min；最后72 ℃反應(yīng)10 min)擴(kuò)增行凝膠電泳；caspase-3 引物序列包括caspase-3上游引物:5′-AAG AAG ACC ATA GCA AAA GGA G-3′，下游引物:5′-CAC AAA GTG ACT GGA TGA ACC-3′;內(nèi)參照β-actin 上游引物:5′-CCA A GG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3′，下游引物:5′-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3′。腓腸肌行石蠟切片加caspase-3抗體染色、封片，光鏡下觀察：50 μL的10%山羊血清(25 ℃) 30 min，50 μL caspase-3兔多克隆抗體(濃度為1∶200)， 4 ℃過夜，50 μL二抗(濃度為1∶150)25 ℃ 20 min，50 μL HRP標(biāo)記鏈親和素(25 ℃)10 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木精復(fù)染，陽性信號以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃進(jìn)行呈色反應(yīng)，陰性對照，應(yīng)用TJTY-300圖像分析軟件測定caspase-3蛋白表達(dá)的水平。

1.2.3腓腸肌細(xì)胞凋亡檢測 于術(shù)后1、4、8周分別取各組失神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本制成厚5 μm石蠟切片,熒光TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞，嚴(yán)格按TUNEL凋亡原位檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，被標(biāo)記的陽性細(xì)胞核呈棕黃色。每張切片選取10個(gè)不重復(fù)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=陽性細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%，取平均數(shù)計(jì)算。

1.2.4Western blot法檢測肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶 術(shù)后1、4、8周將腓腸肌標(biāo)本取等量蛋白采用凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用25 mL封閉液室溫封閉1 h，加入一抗孵育3 h，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，壓片、沖片后采用化學(xué)系統(tǒng)檢測各組Ca2+-ATP酶表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1caspase-3基因表達(dá) caspase-3基因表達(dá)的變化擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,對含插入NT-3基因片段的產(chǎn)物進(jìn)行硬膠回收，并對回收產(chǎn)物序列進(jìn)行酶切鑒定，可見各目的基因及內(nèi)參條帶清晰，見圖1、2。

圖1 生理鹽水組caspase-3電泳表達(dá)

圖2 NT-3 組caspase-3電泳表達(dá)

2.2caspase-3蛋白表達(dá) 兩組caspase-3蛋白表達(dá)在損傷2 h后即開始升高，隨時(shí)間增長繼續(xù)升高；NT-3組在術(shù)后7 d增長比率逐漸下降，caspase-3蛋白的表達(dá)2 h后低于生理鹽水組(P<0.05)。見表1，圖3、4。

圖3 21 d對照組caspase-3蛋白表達(dá)(×200)

2.3肌細(xì)胞凋亡率比較 兩組術(shù)后1周均見肌細(xì)胞凋亡，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4、8周生理鹽水組凋亡細(xì)胞明顯增多，高倍鏡下見細(xì)胞縮小，形狀不規(guī)則，核膜皺縮，核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，而NT-3組陽性細(xì)胞明顯減少。見表2,圖5、6。

表1 各時(shí)間點(diǎn)兩組caspase-3蛋白表達(dá)比較

圖4 21 d NT-3組caspase-3蛋白表達(dá)(×200)

圖5 8周生理鹽水組肌細(xì)胞凋亡情況(×400)

圖6 8周NT-3組肌細(xì)胞凋亡情況(×400)

2.4兩組Ca2+-ATP酶變化 1周生理鹽水組Ca2+-ATP酶水平與NT-3組差別不大，而4、8周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖7 Western blot法Ca2+-ATP酶檢測結(jié)果

指標(biāo)生理鹽水組NT-3組tP肌細(xì)胞凋亡率 1周36.42±0.9835.08±1.010.3760.717 4周43.56±1.0738.47±0.933.2530.012 8周52.74±1.2341.56±0.903.8700.005Ca2+-ATP酶 1周38.26±0.3541.54±0.404.3870.692 4周25.72±0.2133.68±0.314.4830.025 8周13.85±0.1421.69±0.254.6730.006

3 討 論

周圍神經(jīng)損傷后骨骼肌喪失神經(jīng)沖動(dòng)的傳入和支配，由于靶細(xì)胞缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子而發(fā)生肌萎縮。NT-3是較重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠維持體外培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，并促進(jìn)軸突和神經(jīng)元髓鞘生長，維持肌梭、腱和皮膚傳入感覺神經(jīng)元的存活，促進(jìn)神經(jīng)-肌突觸的成熟，防止神經(jīng)損傷后肌肉萎縮[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)損傷后6～12 h內(nèi)其NT-3水平均下調(diào)，2周后NT-3組恢復(fù)到對照組水平8倍；經(jīng)給予外源性NT-3治療后神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮有明顯的延緩作用，并對軸突再生和神經(jīng)修復(fù)亦具有促進(jìn)作用[5-6]。但具體作用機(jī)制目前研究較少，尚不清楚。

肌細(xì)胞凋亡是一種不可逆性的程序性死亡，受細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基、微循環(huán)障礙等調(diào)節(jié),又是凋亡相關(guān)基因caspase、Bcl-2、p53等表達(dá)的結(jié)果[7]。實(shí)驗(yàn)表明NT-3特異性的受體是Trk C ，可通過迅速啟動(dòng)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)元自身信號分子如鈣離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達(dá)和功能狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步促進(jìn)Ca2+-ATP酶發(fā)揮作用預(yù)防失神經(jīng)骨骼肌萎縮[8-9]。Ca2+-ATP酶是參與調(diào)節(jié)Ca2+的主要蛋白，其可以使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi) Ca2+保持高濃度差,這是骨骼肌收縮和舒張的基礎(chǔ)[10]。周圍神經(jīng)損傷后引起骨骼肌內(nèi)的Ca2+-ATP酶能量不足，攝取Ca2+能力下降，細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)Ca2+的大量積聚、鈣超載可能激活細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)程序造成肌細(xì)胞凋亡[11]。

caspase是引起細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)物，可以特異地水解底物蛋白，引起染色體凝聚，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。其中caspase-3是凋亡過程中最重要的蛋白酶,直接介導(dǎo)凋亡實(shí)施[12]。研究發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷后caspase-3表達(dá)增加參與了脊髓損傷細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，NT-3可能通過抑制caspase-3 基因的轉(zhuǎn)錄,減少促凋亡因素,抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，caspase-3 基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平在神經(jīng)損傷后2 h開始增加,但是NT-3組7 d開始下降，而生理鹽水組持續(xù)較高水平。應(yīng)用外源性NT-3 4周后,肌細(xì)胞凋亡率較生理鹽水組明顯減低；失神經(jīng)后4周腓腸肌內(nèi) Ca2+-ATP酶明顯下降，NT-3組中Ca2+-ATP酶較生理鹽水組明顯增加,失神經(jīng)骨骼肌的收縮功能明顯增加(P<0.05)。這說明神經(jīng)損傷后caspase-3基因表達(dá)較高、抗凋亡因素不足和Ca2+-ATP酶下降是導(dǎo)致肌細(xì)胞凋亡的原因之一,而給予NT-3干預(yù)后骨骼肌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)并能下調(diào)活化caspase-3基因和蛋白表達(dá)和升高Ca2+-ATP酶,減少促凋亡因素,抑制肌細(xì)胞的凋亡，從而減緩和保護(hù)失神經(jīng)后肌萎縮促進(jìn)神經(jīng)再生恢復(fù)，為腦、脊髓中樞和周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)提供理論依據(jù)。

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