聶 偉，周洪偉，王繼建

(1.武警重慶總隊醫(yī)院甲乳血管外科 400061；2.重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院普外科 400010；3.浙江省杭州師范大學附屬醫(yī)院普外科 310015)

泛素-蛋白酶體途徑是真核細胞內蛋白質選擇性降解的重要方式。S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)作為一個非常重要的F-box蛋白，參與泛素-蛋白酶體中作為泛素連接酶復合物SCF的組成，同時也是參與降解細胞周期抑制因子P27kip1重要蛋白[1]。根據(jù)既往的研究結果顯示，Skp2和P27kip1分別扮演了原癌基因和抑癌基因的角色，并且在大腸癌組織中的表達呈顯著負相關[2]。那么這種關系發(fā)生的相關機制是什么？以及它們之間是怎樣進行調控？作者針對Skp2在大腸癌中過表達的特點，設計合成了以Skp2為靶點的高度特異性的反義寡核苷酸序列(antisense oligodeoxynucleotide ASODN)，通過對Skp2表達的反義抑制作用，從分子生物學角度探討Skp2與P27kip1蛋白表達呈負相關的可能機制，同時也為大腸癌的基因治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑 大腸癌細胞株SW480，購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心；Skp2 ASODN、無義寡核苷酸(Nonsense oligodeoxynu-cleotide,NSODN)和內標GAPDH引物均由上海生物工程公司合成；脂質體 Lipofectamine TM2000購于美國Invitrogen公司；Trizol試劑盒購于北京鼎國生物技術有限責任公司；RT-PCR試劑盒購于Takara寶生物工程(大連)有限公司。

1.2方法

1.2.1Skp2 ASODN的設計與合成 參閱相關文獻，并根據(jù)Skp2mRNA(GenBank:NM-005983)起始密碼子后180～196 bp堿基序列，設計與其互補的17個堿基寡聚物。Skp2 ASODN序列為 5′-CCT GGG GGA TGT TCT CA- 3′ ；Skp2 NSODN序列為5′-GGC TTC CGG GCA TTT AG-3′,Skp2 NSODN序列的堿基數(shù)目及比例與Skp2 ASODN相同，但序列隨機排列，經GenBank檢索不與基因組序列配對。

1.2.2引物設計與合成 內標GAPDH引物參照文獻。Skp2、P27kip1引物以NewStar軟件自行設計。GAPDH上游引物：5′-CCA TGG AGA AGG CTG GGG-3′，下游引物：5′-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3′，擴增產物為195 bp。P27kip1上游引物：5′-CGT GGC TCG TCG GGG TCT GTG TCT-3′， 下游引物：5′-GGG GCC GCG GGG GTC TGT AGT AG-3′，擴增產物431 bp。Skp2上游引物：5′-AAG AGG AGC CCG ACA GTG AGA ACA-3′,下游引物：5′-GAC AGT ATG CCG TGG AGG GTG GAC-3′，擴增產物481 bp。

1.2.3噻唑藍(MTT)檢測Skp2 ASODN對SW480細胞的增殖抑制影響 將SW480細胞以細胞密度為2×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板。分別加入Skp2 ASODN和Skp2 NSODN，終濃度分別為0.050、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 μmol/L，每組接種5孔，每孔總體系保持200 μL?？瞻讓φ战M加入等量無血清、無抗生素的RPMI-1640液。孵育12 h后，棄去轉染液，添加含血清RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每孔加入MTT(濃度5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每組取3孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩10 min，并在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔490 nm波長吸光度值(A值)。細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組A值/對照組A值)]×100%。每組另外2孔在倒置顯微鏡下觀察其生長情況。

1.2.4流式細胞儀檢測Skp2 ASODN對SW480細胞周期影響 取對數(shù)生長期SW480細胞，經稀釋成終濃度為3.5×105/50 mL細胞懸液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入Skp2 ASODN、Skp2 NSODN至終濃度1.0 μmol/L，加入無血清的培養(yǎng)液使總的體系為200 μL，轉染12 h。吸去轉染液后，添加含有血清的培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)72 h。收集細胞，調整細胞終濃度為1×106/mL，經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，-4 ℃預冷的70%乙醇固定1 h，加RNA酶(100 μg/mL，羅氏公司)500 μL，30 min，加50 μg/mL 碘化丙啶(PI)500 μL，30 min，混合液用300目尼龍網除去雜質。用流式細胞儀進行細胞周期分析。

1.2.5RT-PCR檢測Skp2 mRNA和P27kip1mRNA 實驗分為ASODN、NSODN和對照組。細胞接種和轉染方法同上。PBS洗滌各組細胞，用Trizol核酸提取試劑盒，按照說明分別提取各組細胞中的總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明操作，反應體系為20 μL，反應條件為37 ℃恒溫類30 min，95 ℃ 5 min中止反應，隨后進行PCR反應。取逆轉錄的cDNA產物2 μL，分別加入10×RT緩沖液4.5 μL，Taq酶1 μL，DEPC-ddH2O 42.5 μL，上、下游引物各50 pmoL，反應體系為50 μL進行RT-PCR反應。Skp2擴增條件為94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。P27kip1擴增條件為96 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。GAPDH擴增條件為95 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸8 min。取PCR產物，經2.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠系統(tǒng)成像(美國Bio-Rad公司)，觀察結果并照相。

1.2.6細胞免疫化學染色測定Skp2和P27kip1蛋白表達 取對數(shù)生長期SW480細胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液后，以1×105/孔接種于12孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，分別加入1 μmol/L Skp2 ASODN和NSODN，同時設立空白對照組。孵育12 h后，棄去轉染液，添加含血清RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。經PBS清洗，經95%乙醇固定后，對細胞進行免疫化學染色。根據(jù)前期實驗可知，Skp2 和P27kip1表達均位于細胞核，染色呈棕黃色或黃褐色。

2 結 果

2.1Skp2 ASODN對SW480細胞生長的影響 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)， 經過Skp2 ASODN處理72 h后，SW480細胞形態(tài)未見改變，但其生長速度明顯減慢。見圖1。

A:對照組細胞培養(yǎng)72 h;B:Skp2 ASOND處理后培養(yǎng)72 h。

圖1 Skp2 ASODN對SW480細胞生長的影響

2.2MTT檢測Skp2 ASODN對SW480細胞增殖的抑制作用 當Skp2 ASODN濃度達到0.125 μmol/L時，其A值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著Skp2 ASODN濃度的增加，各濃度A值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。當Skp2 NSODN濃度達到4.000 μmol/L時，其對細胞的增殖也顯示抑制作用(P<0.01)，見表1。

表1 Skp2 ASODN、Skp2 NSODN作用SW480細胞后的A值及增殖抑制率

續(xù)表1 Skp2 ASODN、Skp2 NSODN作用SW480細胞后的A值及增殖抑制率

-：此項無數(shù)據(jù)。

2.3Skp2 ASODN對SW480細胞周期的影響 經Skp2 ASODN作用后，停留于G0/G1期SW480細胞增多(P<0.01)，而進入S期的細胞減少(P<0.05)，在G2/M期的細胞數(shù)量無明顯改變(P>0.05)。見表2。

2.4Skp2 ASODN對Skp2、P27kip1mRNA表達的影響 RT-PCR實驗結果顯示，Skp2 ASODN作用后的SW480細胞中Skp2 mRNA表達降低，P27kip1mRNA表達無變化。見圖2。

2.5Skp2 ASODN對Skp2、P27kip1蛋白表達的影響 細胞免疫化學結果顯示，經Skp2 ASODN處理后SW480細胞中Skp2蛋白表達降低(染色減弱)，P27kip1蛋白表達增強(染色增強)。見圖3。

表2 FCM檢測Skp2 ASODN和Skp2 NSODN處理后SW480的細胞周期結果(%)

M:Marker;1：ASODN Skp2；2：ASODN P27kip1；3：GAPDH；4：NSODN Skp2；5：NSODN P27kip1；6：GAPDH；7：對照組 Skp2；8：對照組 P27kip1；9：GAPDH。

圖2各組Skp2和P27kip1mRNA表達情況

A:經Skp2 ASODN處理后Skp2蛋白表達；B:經Skp2 NSODN處理后Skp2蛋白表達；C:經Skp2 ASODN處理后P27kip1蛋白表達；D:經Skp2 NSODN處理后P27kip1蛋白表達。

圖3經Skp2 ASODN、NSODN處理后Skp2、P27kip1蛋白變化(SP×200)

3 討 論

細胞周期是生命活動的基礎，通過有效的內外調控作用，保證細胞周期有序地進行。腫瘤則是一類漸進性細胞周期調控機制紊亂的疾病，因此，對腫瘤細胞周期調控機制的研究，對認識腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，臨床診斷與治療有著重要意義。作為泛素連接酶，Skp2主要功能是特異性識別磷酸化的底物并介導其泛素化降解。研究顯示，Skp2和細胞周期調控因子之間密切相關，如E2F、cyclinA、cyclinB、cyclinDl、cyclinE、p21、P27kip1和p53都是泛素蛋白酶體途徑的底物[3-5]。近年研究發(fā)現(xiàn) Skp2扮演著原癌基因的角色，參與了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。為了進一步研究Skp2對細胞調控因子的異常泛素化降解作用，Wei等[6]發(fā)現(xiàn)作為調節(jié)細胞周期泛素蛋白酶體之一的SCF復合體，可通過對Skp2的調節(jié)，發(fā)揮對細胞G1期的調控。Nelsen等[7]研究發(fā)現(xiàn)， cyclinE和Skp2轉染大大縮短了肝細胞G1期向S期過渡時間，并且還促進大量肝細胞的復制和肝組織的增生，證實Skp2是一種參與G1期到S期過渡調控的蛋白，扮演致癌基因的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，在許多人類惡性腫瘤中，如食道鱗狀上皮細胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌以及前列腺癌等，Skp2均呈過表達[8-12]。以前的研究發(fā)現(xiàn)，Skp2在大腸癌中也呈過表達，扮演著癌基因的角色。

既往有關P27kip1的研究，主要是其對細胞周期的負性調控方面，發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中均有P27kip1表達的下調現(xiàn)象[13]，推測可能與細胞周期關卡G1/S抑制作用減弱有關。但近年來，隨著對大量腫瘤細胞中Skp2和P27kip1的相關性研究發(fā)現(xiàn)，Skp2-P27kip1通路與人類惡性腫瘤發(fā)生存在密切關系，推測與泛素-蛋白酶體途徑有關[14]。泛素-蛋白酶體途徑是真核細胞選擇性降解蛋白的重要途徑，是參與調控細胞周期、基因轉錄及信號轉導等過程中的關鍵機制。作為F-box蛋白家族成員之一，Skp2參與SCF復合體組成并起到了底物識別的作用，對細胞周期因子P27kip1進行特異性識別并降解，從而參與細胞周期調控。Miyamoto等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Skp2和P27kip1在正常子宮內膜增生期和分泌期表達。59%的子宮內膜癌患者Skp2與P27kip1表達呈負相關。Xiang等[16]發(fā)現(xiàn)在鼻型自然殺傷T細胞淋巴瘤患者中，71%Skp2陽性，73% P27kip1陰性，兩者呈負相關。此外，在乳腺癌、膽管癌等腫瘤中也有類似的報道[17]。本實驗中，作者發(fā)現(xiàn)在大腸癌細胞中Skp2呈過表達，P27kip1表達下調，二者呈負相關，推測Skp2-P27kip1通路參與此過程，其可能的機制與泛素-蛋白酶體途徑有關，主要發(fā)生在轉錄后水平。

作為調控和檢測特定基因表達的重要方法，ASODN技術在近年來取得了顯著的進步。ASODN技術具有合成方便、序列設計簡單、選擇性高、親和力強等特點。通過本研究發(fā)現(xiàn)，利用ASODN的基因封閉和阻斷技術，能有效抑制大腸癌細胞的增殖和生長，不僅證實了Skp2在大腸癌中扮演了原癌基因的角色，同時也為大腸癌的基因治療提供實驗依據(jù)。

綜上所述，大腸癌同其他大多數(shù)腫瘤一樣，可能也存在著過表達的Skp2以泛素-蛋白酶體途徑從而對P27kip1產生過度降解，二者共同參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。隨著對Skp2和P27kip1研究的不斷深入，二者在大腸癌細胞中是否還存在其他作用機制，有待進一步研究。

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