張 銘，張一鳴△，左 偉，錢(qián) 暉，許文榮

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院，江蘇常州 213003;2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新能力、無(wú)限增殖能力以及多向分化潛能的原始細(xì)胞，在腫瘤形成、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵性的作用[1-2]。SALL4 是胚胎干細(xì)胞的特異標(biāo)記物,在人類(lèi)多種腫瘤中均有表達(dá)。本研究從基因和蛋白的角度檢測(cè)了56例宮頸癌組織和35例正常宮頸組織中SALL4的表達(dá)，探討該基因與宮頸癌的關(guān)系及其意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 56例宮頸癌組織(鱗癌46例，腺癌10例)取自2010年3月至2012年12月常州市婦幼保健院婦科接受手術(shù)的宮頸癌患者，年齡21～68歲，平均年齡46.5歲， 35例正常宮頸組織標(biāo)本取自同期該院宮頸科和婦科患者，作為對(duì)照組，年齡22～66歲，平均年齡46.3歲，所有病例均經(jīng)病理檢查確診，且術(shù)前未接受任何治療(本研究遵循的程序符合該院人體試驗(yàn)委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到該委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者簽署臨床研究知情同意書(shū))。

1.2主要試劑 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司， SALL4抗體購(gòu)自Abcam公司，二抗購(gòu)自上海碧云天公司， Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1RT-PCR 取50～100 mg宮頸組織，用Trizol提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。引物由上海生工公司合成，SALL4產(chǎn)物長(zhǎng)度為142 bp，上游引物為5′-TCG ATG GCC AAC TTC CTT C-3′，下游引物為5′-GAG CGG ACT CAC ACT GGA GA-3′,β-actin產(chǎn)物長(zhǎng)度為265 bp，上游引物為5′-CAC GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3′,下游引物為5′-CAT ACT CCT GCT TGC TGA TC-3′。反應(yīng)體系為25 μL，分別含cDNA 1 μL ，10×buffer 2.5 μL,dNTP 2.0 μL,正、反向引物各0.5 μL,TagDNA 聚合酶0.2 μL。PCR循環(huán)條件為:94 ℃ 5 min，94 ℃變性30 s,SALL4(62 ℃)/β-actin(56 ℃)退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。

1.3.2免疫組織化學(xué) 按抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗原修復(fù)，SP法進(jìn)行免疫組化染色，一抗為兔抗人SALL4抗體(1∶800)，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶3 000)，DAB 酶底物顯色,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、干燥、封片,顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟相同。

2 結(jié) 果

2.1SALL4 mRNA在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示SALL4條帶位于142 bp處，內(nèi)參β-actin條帶位于265 bp處，見(jiàn)圖1，灰度掃描結(jié)果表明，宮頸癌組織SALL4 mRNA(2.56±0.22)表達(dá)高于正常宮頸組織(0.38±0.03)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=58.1,P<0.01)。

2.2免疫組化結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，SALL4蛋白在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為80.4%(45/56)、11.4%(4/35)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.177,P<0.01)，在宮頸癌組織SALL4蛋白核漿均有表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)棕黃色，彌漫性分布，見(jiàn)圖2。

1、2：正常宮頸組織；3、4：宮頸癌組織；B：空白對(duì)照；M：DNA marker DL-2000。

圖1 RT-PCR檢測(cè)SALL4 mRNA表達(dá)的瓊脂糖電泳結(jié)果

A：正常宮頸組織；B：宮頸鱗癌組織;C：宮頸腺癌組織，箭頭所指為SALL4陽(yáng)性細(xì)胞。

圖2免疫組化檢測(cè)SALL4蛋白在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達(dá)(×400)

2.3宮頸癌組織中SALL4的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，SALL4 的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)，中、高分化組低于低分化組(χ2=4.226,P=0.039),與年齡、FIGO分期、腫瘤大小、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(χ2=0.004、3.403、1.223、0.827、0.011，P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 宮頸癌組織中SALL4的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

續(xù)表1 宮頸癌組織中SALL4的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,其在病因上是多因素、在病理上是多環(huán)節(jié)、在細(xì)胞生物方面是多信號(hào)途徑、多基因參與的結(jié)果[3]。癌基因和抑癌基因是腫瘤發(fā)生機(jī)制研究中的重大發(fā)現(xiàn)，SALL4基因是2002年由AL-Baradie等研究DRRS綜合征(duane radial ray syndrome，DRRS)家系遺傳時(shí)發(fā)現(xiàn)的原癌基因，由4個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子組成。SALL4基因編碼的蛋白質(zhì)屬于C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄子，定位于細(xì)胞核內(nèi)[4-5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SALL4基因是維持胚胎干細(xì)胞功能的重要調(diào)控基因，其通過(guò)Pousfl調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞和早期胚胎的發(fā)育，在維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新中具有重要作用[6]。多項(xiàng)研究表明，SALL4的表達(dá)與遺傳性疾病、白血病及一些腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[7-8]。

本研究通過(guò)RT-PCR檢測(cè)56例宮頸癌和35正常宮頸組織中SALL4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織SALL4 mRNA表達(dá)高于正常宮頸組織(P<0.01)，免疫組化結(jié)果在蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了這一點(diǎn)，宮頸癌組織中SALL4基因高表達(dá)，提示宮頸癌組織中可能含有表達(dá)SALL4的宮頸癌干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為只有小部分腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生腫瘤并維持腫瘤生長(zhǎng)及異質(zhì)性,是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源[9-10]，作為胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物,SALL4在腫瘤組織中的高表達(dá)表明宮頸細(xì)胞的癌變過(guò)程可能與胚胎基因的激活密切相關(guān),也有研究者認(rèn)為這是干細(xì)胞致癌的一種證據(jù)[11],SALL4與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。本研究根據(jù)免疫組化結(jié)果進(jìn)一步分析了宮頸癌組織中SALL4的表達(dá)與臨床病理資料間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SALL4的陽(yáng)性表達(dá)與宮頸癌的分化狀態(tài)相關(guān)，低分化陽(yáng)性率高于中、高分化(P<0.05)，但與宮頸癌患者的年齡、腫瘤大小、宮頸癌的病理類(lèi)型、臨床分期及有否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，說(shuō)明SALL4不僅參與了宮頸癌的發(fā)生，還可能與宮頸癌的預(yù)后關(guān)系密切。

綜上所述，胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物SALL4在宮頸癌組織中表達(dá)增加，提示宮頸癌中可能存在腫瘤干細(xì)胞，宮頸癌的發(fā)生可能與腫瘤干細(xì)胞關(guān)系密切，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SALL4的陽(yáng)性表達(dá)與宮頸癌的分化狀態(tài)相關(guān)，表明SALL4可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要作用。

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