周游孫伏喜周蓉牛常明郭駿華

小窩蛋白1介導(dǎo)TGF-β信號(hào)通道調(diào)控肺細(xì)胞外基質(zhì)重塑機(jī)制研究

周游①孫伏喜①周蓉①牛常明①郭駿華①

目的：探討caveolin-1通過介導(dǎo)TGF-β信號(hào)通道在體外調(diào)控小鼠肺細(xì)胞外基質(zhì)重塑的機(jī)制研究。方法：選取cav1-/-小鼠作為動(dòng)物模型設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，野生型C57BL/6J小鼠設(shè)為對(duì)照組，檢測(cè)肺機(jī)械性指標(biāo)，測(cè)定Ⅰ型膠原纖維與彈性纖維含量及mRNA水平，檢測(cè)肺血管蛋白滲出及支氣管灌洗液（BAL）中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平，測(cè)定TGF-β下游信號(hào)分子Smad2及ERK1/2水平。結(jié)果：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中肺順應(yīng)性下降，僵硬度增加（P＜0.05）；BAL中總蛋白及白蛋白水平和靜脈注射伊文思藍(lán)在肺組織的含量均明顯增加（P＜0.05）；Ⅰ型膠原纖維與彈性纖維含量及mRNA水平增加（P＜0.05）；Smad2及ERK1/2水平均明顯提高（P＜0.05）；但BAL中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平無差異。結(jié)論：小窩蛋白1通過介導(dǎo)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在體外上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，促進(jìn)肺纖維化發(fā)生。

小窩蛋白1； TGF-β； 細(xì)胞外基質(zhì)； 信號(hào)傳導(dǎo)； 肺纖維化

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸 窘 迫 綜 合 征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是ICU常見的且死亡率高的一種急癥狀態(tài)，近年來隨著機(jī)械通氣、表面活性物質(zhì)替代療法等新技術(shù)應(yīng)用，其存活率已顯著提高。然而，長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧，幸存者易發(fā)生肺部氧化應(yīng)激損傷。目前，高氧肺損傷及肺纖維化已成為ICU最為棘手的問題之一和慢性肺疾病的最常見形式，但目前高氧肺損傷及肺纖維化的確切機(jī)制尚未完全闡明。已知細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的重塑參與了高氧肺損傷的整個(gè)病理過程，若ECM重塑正常，則損傷完全修復(fù)，肺結(jié)構(gòu)正常；若ECM重塑紊亂，將導(dǎo)致肺纖維化。因此，ECM重建是關(guān)系高氧肺損傷結(jié)局的關(guān)鍵因素。

目前已知在Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等細(xì)胞質(zhì)膜上存在約50～100 nm大小的囊性凹陷結(jié)構(gòu)——小窩（caveolae），而小窩蛋白（caveolin，cav）1是小窩胞漿面包被的一種21～24 kD的膜蛋白，是許多信號(hào)分子如TGF-β活性狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)者。TGF-β是一種多效生長(zhǎng)因子，可以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、程序性死亡及ECM產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，cav1可以通過調(diào)節(jié)TGF-β受體表達(dá)從而調(diào)控TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-2]。在變異原誘發(fā)的急性肺損傷小鼠模型中，cav1對(duì)肺間質(zhì)纖維化、肺泡支氣管化及氣道重塑有重要作用，并且發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)增強(qiáng)，膠原分泌增加[3-5]。有研究報(bào)道，cav1基因敲除小鼠出現(xiàn)肺泡腔狹窄、肺泡壁增厚及細(xì)胞過多現(xiàn)象[6]。故推測(cè)cav1可以通過介導(dǎo)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以此調(diào)控ALI/ARDS時(shí)的ECM重塑水平。本研究應(yīng)用cav1-/-小鼠模型探討Cav1對(duì)ECM重塑作用及其具體信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型、主要試劑及分組 本實(shí)驗(yàn)分為兩組：（1）實(shí)驗(yàn)組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為1周齡C57BL/6J cav1-/-小鼠，購自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室；（2）對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為1周齡野生型C57BL/6J小鼠，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。每組均為15只小鼠。主要試劑：Sircol膠原測(cè)定盒購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司。RNeasy RNA試劑盒購自美國(guó)QIAGEN試劑公司。細(xì)胞裂解液購自美國(guó)Sigma試劑公司（含1 mM DTT、1×蛋白酶抑制劑混合物、5 mM EDTA）。

1.2 肺機(jī)械性測(cè)量 動(dòng)態(tài)順應(yīng)性及彈性回縮力參數(shù)通過強(qiáng)迫振蕩法flexiVent呼吸功能研究系統(tǒng)獲得。小鼠按體重予以氯胺酮（100 mg/kg）及甲苯噻嗪（10 mg/kg）靜脈麻醉后插氣管套管后連接flexiVent儀器通暢，參數(shù)設(shè)定如下：PEEP設(shè)定為2 cm H2O，呼吸頻率為150次/min，潮氣量為7.5 mL/kg。氣道阻力、順應(yīng)性及彈性回縮力測(cè)定15次，應(yīng)用單室腔模式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)測(cè)定后處死小鼠，支氣管肺泡灌洗后取肺組織標(biāo)本，以進(jìn)行RNA及蛋白提取。

1.3 組織學(xué)檢查及膠原沉著測(cè)定 肺組織標(biāo)本固定于4%多聚甲醛，包埋切片后予以天狼星紅染色，在光鏡下觀察組織標(biāo)本，利用ImagePro圖像分析儀測(cè)定肺實(shí)質(zhì)及氣道周圍的膠原含量。

取肺組織冰凍后應(yīng)用Sircol膠原測(cè)定試劑盒測(cè)定膠原沉著水平。50 mg肺組織均勻攪碎于500 μL的提取液并4 ℃攪拌過夜，組織勻漿在4 ℃高速離心（15 000 g）1 h，按照試劑盒說明操作，用分光光度儀在540 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)膠原含量曲線圖得出膠原含量。

1.4 肺血管滲出測(cè)定 對(duì)小鼠行支氣管灌洗術(shù)后取灌洗液，在20 ℃時(shí)1000 g低速離心10 min后取上清液儲(chǔ)存于-80 ℃環(huán)境，測(cè)定肺組織滲出總蛋白及白蛋白含量?？偟鞍缀坎捎肂radford法測(cè)定，白蛋白測(cè)定應(yīng)用小鼠白蛋白ELISA試劑盒方法測(cè)定。

應(yīng)用伊文思藍(lán)注射后計(jì)算伊文思藍(lán)含量來評(píng)價(jià)肺血管通透性。取3月齡小鼠麻醉后按20 mg/kg劑量尾靜脈注射伊文思藍(lán)，注射1 h后處死小鼠，開胸后左心室灌注5 mL PBS。取出肺組織，攪碎成組織勻漿固定于10%甲酰胺60 ℃孵育12～18 h，5000 g離心30 min后收集上清液，測(cè)定620 nm和720 nm吸收率。伊文思藍(lán)含量（每克肺組織中伊文思藍(lán)毫克含量）按下列公式計(jì)算：A620-（1.426×A720+0.030），結(jié)果對(duì)比伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出伊文思藍(lán)含量。

1.5 支氣管灌洗液（BAL）中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平 兩組BAL在20 ℃ 1000 g離心10 min后收集細(xì)胞沉積，在100 μL的PBS中打勻，使用標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板來計(jì)算總細(xì)胞數(shù)。分別應(yīng)用小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子ELISA試劑盒測(cè)定BAL中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α 及IFN-γ。

1.6 彈性纖維沉著測(cè)定 利用免疫組化方法檢測(cè)彈性纖維，切片用5%山羊血清封閉1 h，用彈力蛋白一抗4 ℃孵育過夜，在PBS及0.05% Tween-20清洗3次，再與Alexa Fluor 568標(biāo)記的二抗孵育過夜，細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。切片包被后在熒光顯微鏡下觀測(cè)。

1.7 RNA及蛋白表達(dá)分析 應(yīng)用RNeasy RNA試劑盒從肺組織標(biāo)本中提取RNA，按試劑盒說明操作。RNA標(biāo)本在20 ℃與0.05 U/mL DNase Ⅰ孵育15 min，應(yīng)用定量RT-PCR法測(cè)定Ⅰ型膠原α2鏈（col1α2）及彈性蛋白原（eln）mRNA水平。

肺冰凍標(biāo)本用冰PBS液沖洗3次后，組織勻漿加入0.5 mL細(xì)胞裂解液直接煮沸5 min，冰上冷卻后，12 000 rpm離心15 min，取上清液，按照Western blot試劑盒的說明操作，分別加入小鼠anti-Smad2抗體及小鼠anti-ERK1/2抗體后，4 ℃搖擺過夜。漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG多克隆抗體避光室溫孵育2 h，按照發(fā)光試劑盒的說明操作，X線曝光后應(yīng)用NIH Image凝膠圖像處理系統(tǒng)分析凈光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)或ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肺機(jī)械性變化測(cè)定結(jié)果的比較 實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的肺順應(yīng)性較對(duì)照組明顯降低，與此相反實(shí)驗(yàn)組小鼠的肺彈性回縮力及氣道阻力較對(duì)照組均明顯增加（P＜0.05）。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺的僵硬度明顯增加，見表1。

表1 兩組肺機(jī)械性變化測(cè)定結(jié)果的比較（±s）

表1 兩組肺機(jī)械性變化測(cè)定結(jié)果的比較（±s）

*與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 順應(yīng)性（mL/cm H2O）彈性回縮力（cm H2O/mL）氣道阻力（cm H2O/mL）實(shí)驗(yàn)組（n=15） 0.03±0.01* 80.91±10.46* 1.91±0.63*對(duì)照組（n=15） 0.08±0.02 42.13±6.21 0.95±0.24

2.2 肺組織膠原纖維沉著檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組小鼠的氣道周圍及肺實(shí)質(zhì)膠原纖維沉著較對(duì)照組均明顯增加（P＜0.05），見圖1。并且在應(yīng)用Sircol法對(duì)組織勻漿測(cè)定膠原纖維含量結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的膠原纖維含量為（41.2±5.4）μg/mg，而對(duì)照組小鼠為（27.7±3.1）μg/mg，表明實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05）。說明實(shí)驗(yàn)組小鼠肺的膠原纖維沉著明顯增加，也是肺僵硬度增加的病因之一。

2.3 肺血管蛋白滲出及伊文思藍(lán)含量測(cè)定 肺血管滲出過多也是肺僵硬度增加的病因之一，故檢測(cè)BAL中蛋白滲出水平及肺實(shí)質(zhì)伊文思藍(lán)積聚可以反映肺血管滲出狀況。實(shí)驗(yàn)組小鼠BAL中總蛋白及白蛋白水平較對(duì)照組均明顯增加（P＜0.05），且靜脈注射伊文思藍(lán)在肺組織含量也較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），見圖2。

圖1 肺組織膠原纖維沉著檢測(cè)

2.4 兩組BAL中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平測(cè)定結(jié)果的比較 在對(duì)BAL中細(xì)胞含量檢測(cè)顯示兩組無明顯差異（P＞0.05），并且兩組中細(xì)胞因子如IL-2、TNF-α 及IFN-γ也無明顯差異（P＞0.05），見表2。結(jié)果表明，cav1-/-小鼠與野生型小鼠肺組織無明顯炎癥差別。

2.5 col1α2及eln的mRNA水平與彈性纖維沉著測(cè)定 實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中I型膠原α2鏈（col1α2）及彈性蛋白原（eln）mRNA水平均明顯高于對(duì)照組標(biāo)本水平（P＜0.05），見圖3。熒光顯微鏡下觀測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組的肺實(shí)質(zhì)及肺泡壁的彈性纖維分布較對(duì)照組均明顯增加。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組小鼠的肺組織彈性纖維沉著明顯增加。

表2 兩組BAL中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平測(cè)定結(jié)果的比較（±s）

表2 兩組BAL中細(xì)胞含量及細(xì)胞因子水平測(cè)定結(jié)果的比較（±s）

組別 細(xì)胞含量（×105）IL-2 （pg/mL）TNF-α （pg/mL）IFN-γ （pg/mL）實(shí)驗(yàn)組（n=15） 0.6±0.2 0.4±0.2 3.9±2.2 1.9±0.7對(duì)照組（n=15） 0.7±0.7 0.3±0.1 5.0±3.1 2.1±1.2

2.6 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)表達(dá)水平測(cè)定 已知cav1-/-小鼠缺乏cav1會(huì)上調(diào)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而TGF-β 是ECM基因轉(zhuǎn)錄活性主要的調(diào)節(jié)因子。TGF-β下游的信號(hào)通路主要為Smad2和ERK1/2，故本研究應(yīng)用Western blot法檢測(cè)肺組織中Smad2和ERK1/2水平。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中Smad2和ERK1/2水平較對(duì)照組均明顯升高（P＜0.05），見圖4。結(jié)果說明TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)Smad2和ERK1/2在cav1-/-小鼠上調(diào)。

圖3 coI1α2及eIn的mRNA水平測(cè)定

圖4 Smad2和ERK1/2水平測(cè)定

3 討論

長(zhǎng)期以來，有關(guān)小窩蛋白1（cav1）的研究主要集中在膽固醇代謝、腫瘤轉(zhuǎn)移、膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，而在急性肺損傷（acutelung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）所致肺纖維發(fā)病機(jī)制的研究較為少見。研究發(fā)現(xiàn)，cav1廣泛存在于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞膜，對(duì)于形成囊性凹陷結(jié)構(gòu)——小窩（caveolae）至關(guān)重要，而小窩內(nèi)含有多種信號(hào)受體，其中TGF-β信號(hào)通路對(duì)于ECM沉著、肺內(nèi)皮細(xì)胞分化及相關(guān)病理狀態(tài)至關(guān)重要[3]。為了解cav1對(duì)肺的生理功能及結(jié)構(gòu)影響，本研究探討了肺功能、TGF-β信號(hào)通路及ECM重塑間關(guān)系。已有研究顯示，cav1缺乏或降低可以上調(diào)TGF-β水平，而體外培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞時(shí)予以外源性TGF-β則可以上調(diào)數(shù)個(gè)ECM基因轉(zhuǎn)錄[3，7-8，10]。cav1-/-小鼠的肺功能出現(xiàn)有害改變，因而了解TGF-β信號(hào)系統(tǒng)改變是否也會(huì)造成ECM重塑成了需要解決的問題。Ⅰ型膠原纖維和彈性纖維是ECM重要成員，也是決定肺順應(yīng)性重要因素[11]，因而本研究選取I型膠原纖維和彈性纖維作為研究ECM重塑對(duì)象。研究中發(fā)現(xiàn)，cav1-/-小鼠相比與野生型小鼠，其肺順應(yīng)性下降，而肺彈性回縮力及氣道阻力增加，表明肺的僵硬度增加，這與肺的ECM增加及肺血管滲出增加相關(guān)[12-13]。實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)肺組織的Ⅰ型膠原纖維和彈性纖維含量檢測(cè)，顯示cav1-/-小鼠產(chǎn)生ECM是明顯升高，這一點(diǎn)不論從組織切片還是轉(zhuǎn)錄水平都得到了證實(shí)。

同時(shí)研究中顯示，cav1-/-小鼠的支氣管灌洗液蛋白滲出也明顯增加，并且在應(yīng)用伊文思藍(lán)靜脈注射后滲透至肺組織含量明顯增加也證實(shí)cav1-/-小鼠的肺血管通透性增加。在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中，30%細(xì)胞表面存在小窩，因而cav1缺陷會(huì)增加肺血管通透性，促進(jìn)滲出[14]。已知在正常人的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)TGF-β可以上調(diào)NO合成酶的活性，而NO合成酶產(chǎn)生的NO會(huì)增加血管通透性，故TGF-β被認(rèn)為是直接導(dǎo)致肺水腫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物[15-16]。而cav1可以下調(diào)TGF-β信號(hào)水平，因而可以推測(cè)cav1-/-小鼠肺組織中血管滲出增加是因TGF-β過度激活而致使NO合酶活性過強(qiáng)所致。

本研究從以上兩方面證實(shí)cav1可以調(diào)控肺組織ECM重塑水平，進(jìn)而影響肺的順應(yīng)性變化。已知cav1可以調(diào)節(jié)TGF-β表達(dá)水平，但為進(jìn)一步了解cav1是否通過TGF-β信號(hào)系統(tǒng)來調(diào)控ECM重塑，研究選取了TGF-β的兩個(gè)重要下游信號(hào)因子Smad2和ERK1/2作為研究對(duì)象。有研究表明，各種的TGF-β下游信號(hào)途徑如Smads、ERK1/2及p38 MAPK等對(duì)調(diào)控彈性纖維mRNA及轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定有重要作用，比如Smad3缺乏則會(huì)導(dǎo)致肺彈性纖維表達(dá)抑制進(jìn)而出現(xiàn)肺氣腫[17-18]。研究結(jié)果顯示，cav1-/-小鼠的Smad2和ERK1/2表達(dá)明顯增加，證實(shí)cav1介導(dǎo)TGF-β信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控肺ECM重塑。

cav1-/-小鼠具有ALI/ARDS相似的病理特點(diǎn)，如肺膠原積聚、血管通透性增加及肺順應(yīng)性下降等，因而充分了解cav1功能具有很好的臨床相關(guān)性，也為治療ALI/ARDS提供一個(gè)潛在的新型治療靶向。

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The Research of CaveoIin1 to ReguIate Lung ExtraceIIuIar Matrix RemodeIing by Mediating TGF-β SignaI Pathway

/ZHOU You，SUN Fu-xi，ZHOU Rong，et aI.//MedicaI Innovation of China，2014，11（23）：016-020

Objective：To investigate the research of caveolin1 to regulate lung extracellular matrix remodeling by mediating TGF-β signal pathway.Method：C57BL/6J cav1-/-mice were selected as experimental group，and C57BL/6J wild type mice were determined as control group.Lung mechanics index of all mice were measured，type Ⅰ collagenous fibrils and elastic fiber deposition and mRNA level were assayed，lung vascular leakage and cell content & cytokines level in bronchoalveolar lavage were measured，Smad2 and ERK1/2 level regarding as TGF-β downstream signaling molecule were evaluated.ResuIt：Compared with the control group，the lung compliance was down-regulated，elastance and airway resistance were up-regulated in the experimental group（P＜0.05）.The total protein and albumin levels in BAL and intravenous injection of Evans blue content in lung tissue were significantly increased in experimental group（P＜0.05）. The expression of type Ⅰ collagenous fibrils and elastic fiber deposition and mRNA level were increased in experimental group（P＜0.05）.Smad2 and ERK1/2 level were significantly improved（P＜0.05），but cell content and cytokines level in BAL were no significant deviation.ConcIusion：Caveolin1 can up-regulate lung extracellular matrix remodeling by mediating TGF-β signal pathway in vitro and progress pulmonary fibrosis.

Caveolin1； Transforming growth factor-β； Extracellular matrix； Signal conduction；Pulmonary fibrosis

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.23.005

2014-02-12） （本文編輯：歐麗）

①南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 江蘇 南京 210011

周游

First-author’s address：The Second AffiIiated HospitaI of Nanjing MedicaI University，Nanjing 210011，China