楊 強(qiáng)，常玉林，李 蕾，劉朝輝

(1.河北省滄州市中心醫(yī)院麻醉科，河北 滄州 061000;2.河北省滄州市中心醫(yī)院體檢中心，河北 滄州 061000)

膿毒癥引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征是嚴(yán)重?zé)齻?、感染、?chuàng)傷患者的主要死因[1]。最近幾年許多臨床治療方法包括抗炎策略和液體替換用于治療膿毒癥[2-3]，然而這些方法的有效性并沒(méi)有很大進(jìn)展，因此尋找新的臨床干預(yù)方法顯得十分重要。有報(bào)道[4]高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1，HMGB1)是一個(gè)非組氨酸核蛋白，在膿毒癥發(fā)生機(jī)制中是一個(gè)重要晚期炎癥介質(zhì)[5]。拮抗HMGB1治療在許多臨床前炎癥疾病模型上有良好效果[6]。鹽酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride，PHC)可以抑制炎癥反應(yīng)和降低內(nèi)毒素休克大鼠病死率[7]。本研究旨在探討PHC對(duì)膿毒癥病死率、重要器官功能和HMGB1表達(dá)的效果。

1 材料與方法

1.1 材料：48只健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Trizol(Invitrogen公司，美國(guó))；大鼠HMGB1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海滬尚生物科技公司)；大鼠HMGB1和GAPDH擴(kuò)增引物(上海英俊公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立：所有大鼠在手術(shù)前12h空腹，隨后腹腔注射10%水合氯醛(0.4mL/100g)并背側(cè)臥位固定。大鼠膿毒癥模型用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)制備,一條1.5cm切口沿著盲腸根部和腹中線切開(kāi)。盲腸壁穿刺3次沿著結(jié)扎側(cè)用18號(hào)針，隨后進(jìn)行引流以阻止穿刺孔被腸內(nèi)容物堵塞。腸管放回腹腔隨后縫合腹膜腔和皮膚。對(duì)照組僅進(jìn)行腹部切開(kāi)，盲腸分離和腹腔關(guān)閉。所有大鼠快速皮下注射生理鹽水按照術(shù)后3mL/100g給予。

1.2.2 動(dòng)物分組：上述麻醉和固定后在CLP之前進(jìn)行右頸內(nèi)靜脈分離，隨后成功置入頸內(nèi)靜脈24G套管針，套管針與微量注射泵相連。隨機(jī)分為4組，每組12只，包括對(duì)照組(C組)、模型組(CLP組)、早期PHC處理組(PHC+CLP組)和晚期PHC處理組(CLP+PHC組)。C組用生理鹽水替代PHC。PHC+CLP組在CLP前1h給予靜脈注射PHC(0.45mg/kg)；CLP+PHC組在CLP后1h給予靜脈注射PHC(0.45mg/kg)。觀察大鼠的臨床表現(xiàn)。每組大鼠分別在CLP后24h和48h處死收集樣本。

1.2.3 標(biāo)本處理：在大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，從心臟采集5mL血樣，以3 000r/min離心10min。收集血清然后用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)處理。100mg肺組織和收集的血清儲(chǔ)存于-80℃待測(cè)。

1.2.4 檢測(cè)血清中HMGB1水平：血清中HMGB1水平用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書操作(上海滬尚生物科技公司,上海)。

1.2.5 檢測(cè)CLP 24h后血清中生化參數(shù):血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)，尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)，肌酐(creatinine，Cr)和肌酸磷酸激酶(creatine kinase,CK)用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.2.6 檢測(cè)肺組織中HMGB1 mRNA表達(dá)：100mg肺組織制成勻漿后，總RNA用Trizol(Invitrogen公司，美國(guó))進(jìn)行一部提取法抽提，并且隨后RNA濃度用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄用2μg總RNA獲得cDNA,作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。GAPDH作為內(nèi)部參考基因和HMGB1作為靶基因獲得HMGB1和GAPDH在GeneBank的信使RNA序列。特異性引物用Prime5軟件設(shè)計(jì)并且由上海英俊生物科技公司合成(上海，中國(guó))。HMGB1基因序列(158bp)，上游序列為5′-CCATTGGTGATGTTGCAAAG-3′，下游序列為5′-CTTTTTCGCTGCATCAGGTT-3′。GAPDH基因序列，上游序列為5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3′，下游序列為5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在25μL容積體系進(jìn)行，體系含有0.5μL(10mmol/L)上游和下游引物。12.5μL 2倍SYBR Green Mix和雙蒸水。擴(kuò)增條件為預(yù)變性在95℃ 2min；94℃15s，58℃15s，72℃15s，40循環(huán)；收集熒光在72℃。Ct值獲得用于統(tǒng)計(jì)HMGB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量和HMGB1與GAPDH基因的比例。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況和病死率：在CLP組大鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、食欲減低、嗜睡、豎毛、腹瀉和眼分泌物增多。隨著膿毒癥的進(jìn)展發(fā)生窒息并且一些大鼠死亡。尸檢顯示在腹腔中有更多血和化膿性滲出，腸管擴(kuò)張和黑色腫大的盲腸。在CLP后48h，CLP組、PHC+CLP組和CLP+PHC組的死亡數(shù)分別是8、3和4只。顯示CLP具有明顯的致死效果，PHC可以顯著改善生存率，C組無(wú)死亡大鼠，CLP組大鼠生存率低于PHC+CLP組和CLP+PHC組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 PHC對(duì)血清中HMGB1和肺組織HMGB1 mRNA表達(dá)的影響:在膿毒癥模型建立后24h和48h，CLP組的HMGB1水平和HMGB1 mRNA表達(dá)均高于C組(P<0.01)；PHC+CLP組和CLP+PHC組均比CLP組明顯降低(P<0.01)，PHC+CLP組比CLP+PHC組降低的更多。48h與24h比較，只有PHC+CLP組HMGB1 mRNA表達(dá)有明顯降低(P<0.01)；其余指標(biāo)兩時(shí)間點(diǎn)之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

Groups48h surviveC12(100.0)CLP4(33.3)PHC+CLP9(75.0)?CLP+PHC8(66.7)? χ212.703 P0.005

*P<0.05vsC group by χ2test

CLP:cecal ligation and puncture;PHC:penehyclidine hydrochloride

GroupsHMGB1(mg/L)24h48hHMGB1 mRNA(OD)24h48hC4.5±0.44.8±0.50.53±0.150.46±0.02CLP14.2±1.3?13.8±1.2?2.91±0.17?2.31±0.70?PHC+CLP9.1±1.1?#△8.7±0.9?#△1.75±0.03?#△1.47±0.17?#△☆CLP+PHC11.9±1.1?#10.8±1.2?#1.96±0.06?#1.59±0.11?# F195.925174.244411.08826.187 P0.0000.0000.0000.000

*P<0.01vsC group #P<0.01vsCLP group △P<0.05vsCLP+PHC group byqtest ☆P<0.01vs24h byttest

CLP:cecal ligation and puncture;PHC:penehyclidine hydrochloride

2.3 PHC對(duì)CLP后24h血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK的影響：與C組相比，血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在CLP組、PHC+CLP組和CLP+PHC組顯著增加(P<0.05)。與CLP組相比，血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在PHC+CLP組和CLP+PHC組均降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

GroupsALT(U/L)AST(U/L)BUN(mmol/L)Cr(mmol/L)CK(U/L)C43.3±4.7150.1±18.25.8±1.022.6±3.1235.8±25.2CLP215.1±31.1?590.4±102.0?21.6±3.7?58.2±9.0?833.5±152.6?PHC+CLP101.1±15.2?#340.3±57.7?#13.5±2.1?#45.6±5.3?#551.9±123.7?#CLP+PHC123.9±22.6?#372.8±61.4?#11.8±2.7?#48.3±7.4?#510.8±112.5?# F70.69043.80238.96331.37227.674 P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05vsC group #P<0.05vsCLP group byqtest

CLP:cecal ligation and puncture;PHC:penehyclidine hydrochloride

2.4 相關(guān)性分析：血清中HMGB1與肺組織中HMGB1 mRNA呈顯著正相關(guān)(r=0.945，P<0.01)。

3 討 論

CLP誘發(fā)膿毒癥休克大鼠模型并且應(yīng)用到本研究的模型也稱混合性膿毒癥模型。與脂多糖誘發(fā)的內(nèi)毒素休克模型相比，CLP模型可以反映更多臨床上膿毒癥休克的典型特征。觀察本研究中大鼠的臨床表現(xiàn)，應(yīng)用到本研究的膿毒癥模型是成功的。資料顯示CLP后早期病死率高達(dá)50%[8]。目前PHC主要用于麻醉術(shù)前用藥，所以本研究觀察CLP后48h大鼠的生存率。結(jié)果顯示PHC可以明顯改善CLP后大鼠生存率，與文獻(xiàn)報(bào)道的PHC顯著增加內(nèi)毒素休克大鼠生存率一致[7]。

HMGB1是一種非組氨酸蛋白，作為一個(gè)新的潛在的晚期炎性介質(zhì)參與膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，并被認(rèn)為是最重要的晚期炎性介質(zhì)，它在膿毒癥中具有致死效果[9]。Shao等[10]報(bào)道了血清中HMGB1表達(dá)水平與試驗(yàn)性動(dòng)物膿毒癥進(jìn)展和嚴(yán)重性密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CLP組和PHC組HMGB1在相同時(shí)間點(diǎn)血清中和肺組織中顯著增加(P<0.05)；隨后給予PHC，HMGB1水平在PHC組低于CLP組；早期PHC處理組比晚期PHC處理組在相同時(shí)間點(diǎn)血清中HMGB1和肺組織中HMGB1 mRNA表達(dá)更低；并且血清中HMGB1與肺組織中HMGB1 mRNA呈正相關(guān)(r=0.945)。表明PHC可以通過(guò)抑制血清和肺組織中HMGB1在膿毒癥中扮演重要角色，改善膿毒癥大鼠的預(yù)后，并且早期PHC干預(yù)效果更好。

對(duì)于膿毒癥患者經(jīng)常合并多器官功能衰竭的，一個(gè)重要的臨床選藥原則是這個(gè)藥物是否會(huì)對(duì)重要器官產(chǎn)生保護(hù)效果。本研究結(jié)果顯示，與CLP組相比，PHC+CLP組和CLP+PHC組在CLP后24h血清中ALT、AST、BUN、Cr、CK水平明顯降低，顯示PHC對(duì)膿毒癥大鼠重要器官具有保護(hù)效果。許多研究顯示巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞在各種休克和膿毒癥模型中是重要的促炎細(xì)胞因子來(lái)源。祝春華等[11]報(bào)道庫(kù)普弗細(xì)胞被認(rèn)為是膿毒癥急性期促炎因子的一個(gè)主要來(lái)源。在本研究中PHC是否通過(guò)特異性庫(kù)普弗細(xì)胞反映具有肝臟保護(hù)效果仍有待進(jìn)一步研究，如PHC對(duì)膿毒癥大鼠重要器官保護(hù)效果的具體機(jī)制如何？PHC參與的保護(hù)效果與HMGB1的關(guān)系如何？這是我們研究的局限性。PHC抑制HMGB1水平的機(jī)制尚不十分清楚，但可能與下列因素有關(guān)，PHC可以降低膿毒癥動(dòng)物一氧化氮(nitric oxide,NO)水平，NO可以產(chǎn)生對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，并且NO與HMGB1密切相關(guān)[12]；PHC可以降低膿毒癥大鼠肝臟細(xì)胞核因子κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)活性，抑制TNF-α等促炎細(xì)胞因子水平，具有抗炎作用；PHC可以抑制過(guò)氧亞硝酸陰離子(peroxynitrite,ONOO-)活性，來(lái)阻斷內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ONOO-介導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)移，部分抑制NF-κB活性導(dǎo)致的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)擴(kuò)增。NF-κB參與HMGB1/RAGE信號(hào)傳導(dǎo)，所以抑制NF-κB活性可以導(dǎo)致HMGB1降低。

總之，膿毒癥大鼠血清中HMGB1與肺組織中HMGB1 mRNA密切相關(guān)。PHC可以抑制HMGB1和HMGB1 mRNA，并且明顯改善膿毒癥大鼠的生存率。PHC在改善膿毒癥大鼠預(yù)后上扮演重要角色。與此同時(shí)，PHC對(duì)膿毒癥大鼠的肝、腎和心臟具有保護(hù)效果。本研究對(duì)膿毒癥或膿毒性休克患者的治療提供了新的選擇。然而，尚需進(jìn)一步研究PHC在膿毒癥中扮演抗炎角色的具體機(jī)制。

[1] MARTIN GS,MANNINO DM,EATON S,et al.The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000[J].N Engl J Med,2003,348(16):1546-1554.

[2] COHEN S,HURD E,CUSH J,et al.Treatment of rheumatoid arthritis with anakinra,a recombinant human interleukin-1 receptor antagonist,in combination with methotrexate:results of a twenty-four-week,multicenter,randomized,double-blind,placebo-controlled trial[J].Arthritis Rheum,2002,46(3):614-624.

[3] EICHACKER PQ,PARENT C,KALIL A,et al.Risk and the efficacy of antiinflammatory agents: retrospective and confirmatory studies of sepsis[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,166(9):1197-1205.

[4] SCAFFIDI P,MISTELI T,BIANCHI ME.Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J].Nature,2002,418(6894):191-195.

[5] WANG H,YANG H,CZURA CJ,et al.HMGB1 as a late mediator of lethal systemic inflammation[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,164(10 Pt 1):1768-1773.

[6] YANG H,TRACEY KJ.Targeting HMGB1 in inflammation[J].Biochim Biophys Acta,2010,1799(1/2):149-156.

[7] ZHANG J,WANG Y，WANG C,et al.Protective effects of penehyclidine hydrochloride on septic mice and its mechanism[J].Shock,2007,28(6):727-732.

[8] WEISS YG,BELLIN L,KIM PK,et al.Compensatory hepatic regeneration after mild,but not fulminant,intraperitoneal sepsis in rats[J].Am J Physiol Gastroint Liver Physiol,2001,280(5):G968-973.

[9] LOTZE MT,TRACEY KJ.High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal[J].Nat Rev Immunol,2005,5(4):331-342.

[10] SHAO YM,YAO HG,LIANG XZ,et al.Relation between level of expression of high mobility group protein B1 in hepatic tissue with the severity and prognosis of sepsis in rat[J].Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue,2006,18(11):668-672.

[11] 祝春華,溫雅,王力娜，等.替米沙坦對(duì)大鼠腦缺血后核因子κB表達(dá)的影響[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,34(5):497-500.

[12] DEGRYSE B,BONALDI T,SCAFFIDI P,et al.The high mobility group (HMG) boxes of the nuclear protein HMG1 induce chemotaxis and cytoskeleton reorganization in rat smooth muscle cells[J].J Cell Biol,2001,152(6):1197-1206.