吳雪園，黃翠影，楊路亭

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性為特征的臨床綜合征。疾病譜從單純脂肪肝經(jīng)非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)可進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌、肝衰竭[1]。肝脂肪變與糖尿病、高血壓、心血管事件等的發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)，尤其是NASH，可增加心血管病和惡性腫瘤患者的病死率；同時NASH相關(guān)肝硬化是原發(fā)性肝癌的獨(dú)立危險因素[2]，因此，NAFLD已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。近年來由于高熱量飲食，體育鍛煉減少等生活方式改變，我國NAFLD患病逐年增加，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病[3]。但其發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，治療上也缺乏有效措施。目前尚無理想的能夠完整表達(dá)人類NASH的動物模型，本實(shí)驗(yàn)旨在通過飼喂高脂飲食建立大鼠NASH模型，并探討氧化應(yīng)激在其發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：清潔級Wistar大鼠30只(雄性)，體質(zhì)量180～200g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)條件為室溫(22±1)℃，濕度為(55±10)%。

1.2 飼料：普通基礎(chǔ)飼料購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，高脂飼料由88%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+10%豬油組成。

1.3 試劑：血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、過氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)購自南京建成科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物模型建立：30只Wistar大鼠以普通基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成2組。正常組10只飼喂普通基礎(chǔ)飼料，模型組20只飼喂高脂飼料，自由飲水，每周稱體質(zhì)量1次并記錄。實(shí)驗(yàn)8周末從模型組隨機(jī)挑選10只大鼠處死，12周末處死正常組10只及模型組剩余10只大鼠，留取血清及肝組織標(biāo)本備用。

1.4.2 標(biāo)本采集：大鼠取材前禁食12h，10%水合氯醛腹腔麻醉，采集心臟血5mL于抗凝管中，以3 000r/min，15min離心后獲取血清分裝標(biāo)記，-20℃保存?zhèn)溆?；摘取整個肝臟標(biāo)本，生理鹽水沖去多余血液，濾紙吸干表面水分后稱濕質(zhì)量；取肝左葉組織(5mm×5mm×3mm大小)浸泡于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)。

1.4.3 觀察指標(biāo)及測定方法：實(shí)驗(yàn)期間每周記錄大鼠體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時稱大鼠肝濕質(zhì)量，并計(jì)算肝指數(shù)(肝指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量)。SOD、MDA、GSH-PX測定嚴(yán)格按試劑盒規(guī)范操作。病理學(xué)觀察參照美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組指南，統(tǒng)計(jì)NAFLD活動度積分(NAFLD activity score，NAS)。NAS 0～8分。①肝細(xì)胞脂肪變，0分為<5%，1分為5%～33%，2分為34%～66%，3分為>66%。②小葉內(nèi)炎癥(20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶)，0分為無，1分為<2個，2分為2～4個，3分為>4個。③肝細(xì)胞氣球樣變，0分為無，1分為少見，2分為多見。NAS<3分可排除NASH，NAS>4分則可診斷NASH，介于兩者之間者為NASH可能。規(guī)定不伴有小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變和纖維化但肝脂肪變>33%者為單純性脂肪肝，脂肪變達(dá)不到此程度者僅稱為肝細(xì)胞脂肪變[4]。

2 結(jié) 果

2.1 肝臟的一般情況：正常組的肝組織形態(tài)正常，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地紅潤柔軟。模型組8周末肝臟體積增大，包膜稍緊張，邊緣圓鈍；12周末肝臟體積明顯增大，包膜緊張，部分肝臟呈奶黃色，切面油膩。

2.2 肝指數(shù)：與正常組相比，模型組體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)均顯著增加和升高(P<0.05)；與模型組8周比較，模型組12組體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)均明顯增加和升高(P<0.05)。見表1。

組別處死時間體質(zhì)量(g)肝濕質(zhì)量(g)肝指數(shù)(%)正常組12周356.0±26.89.6±0.82.7±0.1模型組8周391.0±35.2?12.2±3.1?3.1±0.5?12周445.0±28.1?#17.2±1.5?#3.8±0.3?#

*P<0.05與正常組比較 #P<0.05與模型組8周比較(q檢驗(yàn))

2.3 光鏡下觀察：正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列規(guī)則，肝細(xì)胞大小均勻一致，胞核呈圓形，形態(tài)規(guī)則，NAS均為0(圖1)；模型組在8周末肝細(xì)胞腫脹，有少量肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見小泡性或顆粒狀脂質(zhì)空泡，NAS均≤4分，符合單純性脂肪性肝炎或NASH可能表現(xiàn)(圖2)；12周末肝細(xì)胞極度腫脹，肝細(xì)胞排列紊亂，索狀結(jié)構(gòu)不清，肝竇狹窄，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿大量脂肪空泡，酷似泡沫細(xì)胞，界限不清，伴程度不同的炎癥細(xì)胞浸潤，少數(shù)出現(xiàn)點(diǎn)、灶狀壞死，但未見纖維化，NAS均>4分，符合NASH病理改變(圖3)。

圖1 對照組肝索排列規(guī)則，肝細(xì)胞大小均勻一致，胞核呈圓形，形態(tài)規(guī)則(HE ×100)

圖2 模型8周組肝細(xì)胞腫脹，有少量肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見小泡性或顆粒狀脂質(zhì)空泡(HE ×100)

圖3 模型12周組肝細(xì)胞極度腫脹，排列紊亂，胞質(zhì)內(nèi)充滿大量脂肪空泡，伴炎癥細(xì)胞浸潤(HE ×100)

2.4 血清指標(biāo)：與正常組相比，模型組8周末血清MDA開始上升，SOD、GSH-PX開始下降(P<0.05)，隨時間延長12周末MDA水平進(jìn)一步升高，SOD、GSH-PX活力進(jìn)一步降低(P<0.05)。見表2。

組別處死時間MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)GSH-PX(酶活力單位)正常組12周5.8±0.59.3±0.31 197.9±102.2模型組8周6.9±0.6?6.9±0.1?869.9±90.8?12周9.7±0.1?#5.6±0.5?#617.2±96.4?#

*P<0.05與正常組比較 #P<0.05與模型組8周比較(q檢驗(yàn))

MDA：malondialdehyde；SOD：superoxide dismutase；GSH-PX：glutathione peroxidase

3 討 論

NASH是單純性脂肪肝發(fā)展為NASH相關(guān)性肝硬化及肝細(xì)胞癌的必經(jīng)病理階段，合適的NASH動物模型成為實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵。NAFLD動物模型大體分為兩類[5]，即影響肝內(nèi)脂肪酸氧化的基因敲除或突變模型與環(huán)境因素(飲食與藥物)導(dǎo)致肝內(nèi)脂肪酸合成和氧化不平衡引發(fā)的脂肪肝模型。高脂飲食建立大鼠NASH模型符合人類脂肪肝發(fā)病特點(diǎn)，本研究模型組大鼠的肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)均明顯高于正常組；病理學(xué)角度觀察，模型組大鼠肝臟體積增大，包膜緊張，呈奶黃色，切面油膩感，肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪變性，伴炎癥、壞死，且隨造模時間延長，病變加重，鏡下表現(xiàn)和人類脂肪肝一致。

自由基介導(dǎo)的肝損傷是NASH的重要發(fā)病機(jī)制，其主要表現(xiàn)為氧化產(chǎn)物增多和(或)過氧化作用減弱。高脂飲食使血清游離脂肪酸增加，當(dāng)肝細(xì)胞產(chǎn)生的大量反應(yīng)性氧化物(reactive oxygen species,ROS)超過抗氧化系統(tǒng)清除能力時便產(chǎn)生氧化應(yīng)激，ROS與膜磷脂的不飽和脂肪酸反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物又可改變線粒體DNA，抑制呼吸鏈的電子傳遞，進(jìn)一步增加反應(yīng)性氧產(chǎn)物和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成[6-7]。SOD是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中的最重要的抗氧化酶，GSH-PX可特異性催化還原性谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜及其功能作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清SOD和GSH-PX下降明顯，而脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物MDA明顯升高。表明NASH發(fā)生過程中產(chǎn)生了大量自由基和脂質(zhì)過氧化物，消耗了大量SOD、GSH-PX，損害機(jī)體抗氧化防御機(jī)制，機(jī)體不能清除過多的自由基而導(dǎo)致肝損傷，氧化應(yīng)激是NASH發(fā)病的重要機(jī)制之一。

綜上所述，高脂飲食所建立的NASH模型具有操作簡單、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性好、動物病死率低、病變逐漸形成等優(yōu)點(diǎn)，符合人類NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程。

[1] VERBEEK J,CASSIMAN D，LANNOO M,et al.Treatment of non-alcoholic fatty liver disease: can we already face the epidemic? [J].Acta Gastroenterol Belg，2013，76(2):200-209.

[2] 段曉燕,范建高.日本東京2010非酒精性脂肪性肝炎專題報(bào)道[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2011,20(1):1-7.

[3] 鄭全喜,王昆,劉超.非酒精性脂肪性肝病動物模型的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(2):357-360.

[4] 范建高.中國非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)[J/CD].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志：電子版,2012,4(7):4-10.

[5] 南月敏,王蕾,李良霄,等.非酒精性脂肪肝動物模型研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(1):67-69.

[6] 董婷,盧勝家,劉璇,等.氧化應(yīng)激在非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J].肝臟,2012,17(8):602-604.

[7] 蔣艷明,陸璐,錢建成,等.復(fù)方楂金顆粒劑對非酒精性脂肪性肝炎大鼠氧化應(yīng)激的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(9):2066-2069.