張時(shí)超黃愛全侯婭慧董翠婷劉佳睿張杰牛娜

IgG在人肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其臨床意義*

張時(shí)超①黃愛全①侯婭慧①董翠婷①劉佳睿①?gòu)埥堍倥Ｄ娶?/p>

目的：研究腫瘤源性IgG在人肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)和分布情況及其與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系。方法：分別應(yīng)用免疫組化二步法和原位雜交檢測(cè)60例肝細(xì)胞肝癌組織及其周圍正常肝組織中IgG蛋白和IgG mRNA的表達(dá)，分析IgG的表達(dá)水平與9項(xiàng)肝細(xì)胞肝癌的臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果：肝癌組織中IgG的表達(dá)明顯高于其周圍正常肝組織，且兩者表達(dá)程度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）；IgG在腫瘤組織中的異常高表達(dá)與腫瘤分化程度和pTNM分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021），與血漿AFP濃度呈正相關(guān)（r=0.336，P=0.009），與年齡、性別、腫瘤包膜的完整性、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)和一年內(nèi)是否復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論：肝癌細(xì)胞所產(chǎn)生的IgG與腫瘤的分化、pTMN分期相關(guān)，可能作為輔助肝細(xì)胞肝癌病理學(xué)診斷和預(yù)后評(píng)估的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

IgG； 肝癌； 臨床病理學(xué)指標(biāo)； 原位雜交； 免疫組織化學(xué)

First-author’s address：Weifang Medicial University，Weifang 261053，China doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.008

近來多項(xiàng)研究證明，乳腺癌、大腸癌、胃癌和肺癌等源于上皮的惡性腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生IgG[1-6]。邱曉彥等[4]最早發(fā)現(xiàn)Ig樣蛋白的表達(dá)與惡性腫瘤的分化有關(guān)；依據(jù)腫瘤的分化程度不同，Ig樣蛋白的表達(dá)水平也不同，即分化程度越高，表達(dá)強(qiáng)度越低，并證實(shí)該Ig樣蛋白為IgG；葉雪等[7]發(fā)現(xiàn)在惡性卵巢上皮性癌中IgG的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常卵巢，IgG的表達(dá)水平與卵巢癌的臨床分期和病理分級(jí)無相關(guān)性；李浩勇等[6]對(duì)膀胱癌研究發(fā)現(xiàn)：膀胱癌細(xì)胞能夠表達(dá)IgG，其抗體體外對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，且具有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)；Niu等[8]研究了IgG的表達(dá)與結(jié)直腸癌的生物學(xué)指標(biāo)和臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，通過siRNA干擾下調(diào)IgG的表達(dá)，可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞（LOVO細(xì)胞）的增殖、克隆形成和侵襲能力，提示腫瘤源性IgG具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移的作用。肝癌亦屬于上皮性惡性腫瘤，但是目前對(duì)于IgG在肝癌組織中的表達(dá)與分布情況及其與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系的研究尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化技術(shù)和原位雜交技術(shù)檢測(cè)肝癌組織中IgG的表達(dá)情況，進(jìn)而分析其表達(dá)水平和肝細(xì)胞肝癌9項(xiàng)臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，以期為肝細(xì)胞肝癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和濰坊市民醫(yī)院2010-2012年手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本60例，其中男40例，女20例，平均年齡45歲，患者術(shù)前均未采取任何治療措施。所有肝癌病例隨訪12～18個(gè)月。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的書面許可。所有新鮮標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛/PBS固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片。

1.2 免疫組化方法 采用PV-9000兩步法（試劑盒購(gòu)自美國(guó)Zymed公司）進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。切片常規(guī)脫蠟，入水，枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)，經(jīng)3%過氧化氫37 ℃孵育20 min后，滴加小鼠抗人IgG單克隆抗體（1：1000，購(gòu)自美國(guó)sigma公司），4 ℃濕盒過夜，滴加試劑1（聚合物輔助劑），37 ℃孵育30 min，滴加試劑2（辣根過氧化素）標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min。各步驟之間均是PBS沖洗3次，每次5 min。AEC顯色，蘇木素復(fù)染，甘油明膠封片。以手術(shù)切除的扁桃體組織作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 原位雜交方法 切片二甲苯脫蠟，乙醇梯度透明至PBS反復(fù)沖洗，酶消化，經(jīng)預(yù)雜交，滴 50μL含探針的雜交液，45 ℃保溫，20 h。將切片浸泡于5×SSC （37 ℃）中，后依次經(jīng)5%甲酰胺2×SSC（37 ℃）清洗15 min。PBS Buffer Ⅰ漂洗一次后，滴加50 μL馬血清封閉液，置濕暗盒中室溫1 h。后滴加Anti-Dig-Ab（1∶100，購(gòu)自瑞士roche公司），室溫1 h后BufferⅠ、Ⅱ液依次漂洗數(shù)次，NBT-BCIP顯色。以結(jié)腸黏膜下孤立淋巴結(jié)作為陽性對(duì)照，以IgG正義探針代替反義探針作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果評(píng)分 采用雙盲法，由3位病理學(xué)教授在400×的顯微放大倍數(shù)下隨機(jī)對(duì)染色切片獨(dú)立評(píng)分，所得平均分作為最終結(jié)果。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）陽性細(xì)胞數(shù)所占比例：小于5%為0，5%～25%為1，25%～50%為2，大于50%為3；（2）染色強(qiáng)度：未著色為0，淡紅色或粉紅色為1，紅色為2，深紅色為3。兩項(xiàng)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)得分之和為0～3分的切片標(biāo)記為弱染色，陰性；4～6分的切片標(biāo)記為強(qiáng)染色，陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較采用Pearson χ2及Fisher確切概率法檢驗(yàn)分析，評(píng)估IgG的表達(dá)情況與臨床病理學(xué)參數(shù)（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤分化程度、AFP濃度、pTNM分期、1年內(nèi)是否復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IgG蛋白在肝癌組織的表達(dá)及免疫組化檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示60例肝癌組織的IgG蛋白陽性率為85.00%（51/60），癌周正常肝組織的陽性率為6.67%（4/60），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。IgG蛋白陽性染色主要定位于肝癌細(xì)胞胞漿和胞膜。

2.2 IgG mRNA在肝癌組織的表達(dá)及原位雜交結(jié)果 IgG mRNA陽性信號(hào)位于肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞胞漿，為藍(lán)紫色，呈顆粒狀，與免疫組化結(jié)果具有良好的一致性，從mRNA水平證實(shí)了肝細(xì)胞肝癌組織自身具有產(chǎn)生IgG的能力。

2.3 IgG在肝癌組織中的表達(dá)和臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 IgG的異常高表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌分化程度和pTNM分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）；與血漿AFP濃度呈正相關(guān)（r=0.336，P=0.009）；與年齡、性別、腫瘤包膜完整性、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)和一年內(nèi)是否復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P＞0.05），見表1。

3 討論

免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）是體內(nèi)免疫球蛋白家族中含量最高的一種，在機(jī)體抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。經(jīng)典免疫學(xué)理論認(rèn)為IgG僅可由B淋巴細(xì)胞經(jīng)成熟分化過程才能夠特異性合成并分泌。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IgG在其他多種上皮性惡性腫瘤組織和細(xì)胞系中也存在異常高表達(dá)的現(xiàn)象[1-2，5，7-8]。Niu等[8]最近發(fā)現(xiàn)IgG在結(jié)直腸癌組織中和CRC細(xì)胞中高度表達(dá)，而且此高度表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴

結(jié)轉(zhuǎn)移和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有密切的關(guān)系，提示腫瘤源性IgG可能對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要影響。有研究顯示在肝細(xì)胞肝癌患者的血漿中和肝癌細(xì)胞系（BCL-7402）中均可檢測(cè)到IgG的含量異常增高[2，5，9]。但是在肝癌組織中的表達(dá)情況未有報(bào)道，肝癌細(xì)胞所分泌的IgG的功能未知，其表達(dá)和癌癥的臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系也有待于研究。

表1 肝癌組織中IgG的表達(dá)和臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 例

在本項(xiàng)研究中，筆者分別從蛋白質(zhì)水平和mRNA水平證明了肝癌組織可以產(chǎn)生IgG。IgG在肝癌中的高表達(dá)（85.00%）與腫瘤的分化程度和pTNM分期呈負(fù)相關(guān)，IgG在分化較差（低分化或未分化）或在處于pTNM Ⅲ～Ⅳ期的肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)比在分化較好（中分化或高分化）或在處于pTNM Ⅰ～Ⅱ期的肝細(xì)胞肝癌組織中更為明顯；IgG的高表達(dá)與血漿AFP濃度呈正相關(guān)，與年齡、性別、腫瘤包膜的完整性、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)和一年內(nèi)是否復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腫瘤源性IgG可能與腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。免疫球蛋白能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的現(xiàn)象已有報(bào)道，這主要與“抗癌抗體”阻斷癌細(xì)胞表面的靶表位有關(guān)[10-13]。Taylor等[14]在研究卵巢癌中發(fā)現(xiàn)異常糖基化的免疫球蛋白分子不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，免疫球蛋白重鏈，T淋巴細(xì)胞受體（例如：TCR-a，TCR-b），免疫球蛋白樣黏附分子（例如：CD47，CD54）均可在癌細(xì)胞中表達(dá)[15]。免疫球蛋白抗體和T淋巴細(xì)胞受體可啟動(dòng)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用，致使癌細(xì)胞凋亡。所以免疫蛋白超家族對(duì)于腫瘤細(xì)胞可能具有自身保護(hù)作用，并與癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。邱曉彥等[4]早期研究了3例肝癌組織，其分化程度均為中度，研究結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞中Ig蛋白均具有很高的表達(dá)量，因此認(rèn)為在肝癌組織中IgG的表達(dá)程度與腫瘤的分化無相關(guān)性。而本研究提示IgG在肝癌中的異常表達(dá)與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)。這種差異可能由于樣本量大小不同造成。

甲胎蛋白（AFP）是分子量為64 000～70 000道爾頓的一種糖蛋白，主要由肝細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體合成，是胎兒成長(zhǎng)發(fā)育的重要蛋白，具有保護(hù)胚胎不受母體排斥的作用。AFP在出生后立即消失，若再次出現(xiàn)則提示肝癌或生殖胚胎癌，因此AFP是肝癌診斷、治療和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。賈戶亮等[16]分析腫瘤數(shù)目、大小和pTNM分期不同的肝細(xì)胞肝癌的患者血清AFP水平顯示，AFP水平的高低與腫瘤的大小、數(shù)目和pTNM分期均呈正相關(guān)，其中pTNM Ⅰ期與pTNM Ⅲ～Ⅳ期以及pTNM Ⅱ期與pTNM Ⅲ～Ⅳ期肝細(xì)胞肝癌患者血清AFP水平具有顯著的差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清AFP水平較高（＞400 μg/L）的肝細(xì)胞肝癌患者組的IgG陽性表達(dá)率（92.8%，39/42），比血清AFP水平較低（≤400 μg/L）的肝細(xì)胞肝癌患者（66.7%，12/18）組顯著增高，與先前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。盡管血清AFP含量水平對(duì)肝癌的早期診斷有重要意義，但是并非所有AFP升高都可以斷定為肝癌，而且并非所有血清AFP含量水平正常就能排除肝癌的可能。在肝炎、肝硬化活動(dòng)灶等疾病中亦可檢測(cè)到高水平含量的血清AFP，因此僅僅根據(jù)血清AFP濃度來對(duì)肝細(xì)胞肝癌進(jìn)行早期診斷是不夠準(zhǔn)確的[17-18]。所以聯(lián)合腫瘤源性IgG表達(dá)水平的檢測(cè)可提高陽性檢出率，降低漏診率和誤診。

綜上所述，在肝癌組織中IgG表達(dá)顯著增高，IgG的表達(dá)水平與腫瘤的分化、分期有著密切的關(guān)系。這可為以后的肝癌的早期診斷和分期判斷提供了又一重要指標(biāo)。研究IgG的表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)分化的關(guān)系，有助于為腫瘤的免疫治療提供理想的理論依據(jù)，但是對(duì)于其功能與分子機(jī)制的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

[1]汪渙，張叔人，何祖根，等.免疫球蛋白樣物質(zhì)在上皮來源的惡性腫瘤中的表達(dá)[J].中國(guó)腫瘤臨床，2001，28（12）：169-171.

[2]邱曉彥，楊貴貞.惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在免疫球蛋白樣物質(zhì)[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，22（5）：572-575.

[3]邱曉彥，楊貴貞.惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)Ig樣物質(zhì)的特性及其基因結(jié)構(gòu)分析[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，1996，5（12）：296.

[4]邱曉彥，侯春梅，李秀森，等.Ig樣蛋白的表達(dá)與惡性腫瘤分化及增殖細(xì)胞核抗原的相關(guān)性分析[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，

1999，23（1）：16-18.

[5]邱曉彥，侯春梅，李秀森，等.多種腫瘤傳代細(xì)胞中Ig樣物質(zhì)存在與檢測(cè)[J].癌癥，1999，18（11）：180-181，184.

[6]李浩勇，梁培育，朱孝峰，等.免疫球蛋白G在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)及其抗體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究[J].中國(guó)生理病理雜志，2007，23（6）：1068-1073.

[7]葉雪，郭慧方，昌曉紅，等.免疫球蛋白IgG在卵巢上皮性癌的表達(dá)[J].中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志，2007，8（2）：192-194.

[8] Niu N，Zhang J，Huang T，et al.IgG expression in human colorectal cancer and its relationship to cancer cell behaviors [J].Plos One，2012，7（11）：e47 362.

[9] Olubuyide I O，Salimonu L S，Adeniran S O.Soluble immune complexes and immunoglobulin （IgG， IgA and IgM） levels in Nigerians with primary liver cell carcinoma[J].African Journal of Medicine and Medical Sciences，1993，22（4）：57.

[10] Schreiber H，Wu T H，Nachman J，et al.Immunological enhancement of primary tumor development and its prevention[C]. Seminars in Cancer Biology，Academic Press，2000，10（5）：351-357.

[11] Prehn R T.Stimulatory effects of immune reactions upon the growths of untransplanted tumors[J].Cancer Research，1994，54（4）：908-914.

[12] Manson L A.Anti-tumor immune responses of the tumor-bearing host：the case for antibody-mediated immunologic enhancement[J].Clinical Immunology and Immunopathology，1994，72（1）：1-8.

[13] Sj?gren H O，Hellstr?m I，Bansal S C，et al.Suggestive evidence that the "blocking antibodies" of tumor-bearing individuals may be antigen-antibody complexes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1971，68（6）：1372-1375.

[14] Taylor D D，Gercel-Taylor C.Tumor-reactive immunoglobulins in ovarian cancer： diagnostic and therapeutic significance?（review）[J]. Oncology Reports，1998，5（6）：1519.

[15] Lee G，Zhu M，Ge B，et al.Widespread expressions of immunoglobulin superfamily proteins in cancer cells[J].Cancer Immunol Immunother，2012，61（1）：89-99.

[16]賈戶亮，刑戌健，葉青海.甲胎蛋白在原發(fā)性肝癌臨床診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，30（4）：440-443.

[17]趙恒，廖靜，劉瑜.甲胎蛋白與肝癌[J].臨床肝膽病雜志，2008，24（5）：385-387.

[18]雷鳴.原發(fā)性肝癌腫瘤標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010，7（7）：189-190.

IgG Expression in Hepatocellular Carcinoma and Its Significance

/ZHANG Shi-chao，HUANG Ai-quan，HOU Ya-hui，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（18）：023-026

Objective：To investigate the expression and distribution of IgG in human liver cancer cells and its correlation with clinicopathological factors of hepatocellular carcinoma.Method：Fresh and paraffin-embedded tissues from 60 cases of HCC tumor with the matched normal liver specimens were detected by two-step immunohistochemistry and in situ hybridization for the expression of IgG protein and mRNA respectively. The relationship between cancerderived IgG expression and 9 clinicopathological factors were analyzed statistically.Result：Signals of IgG protein in hepatocellular carcinoma cancer cells was significantly stronger than that in its corresponding normal tissues （P=0.001）；the over-expression of IgG was negatively correlated with several clinicopathological factors such as tumor differentiation grade and pTNM （r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）， and positively associated with AFP concentration in serum （r=0.336，P=0.009）. However， no correlationship with age， gender， capsular infiltration，tumor size， tumor quantity and recurrence or metastasis of the disease within 1 year was found （P＞0.05）. Conclusion：Liver-cancer-derived IgG may has a profound impact on the differentiation and pTNM staging of liver cancer cell， and might be served as a tumour marker to help pathological diagnosis and evaluate the prognosis for patients.

IgG； Liver cancer； Clinical pathological factors； In situ hybridization；Immunohistochemistry

2014-03-18） （本文編輯：蔡元元）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81100885）；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家獎(jiǎng)勵(lì)基金資助項(xiàng)目（BS2011SW051）

①濰坊醫(yī)學(xué)院 山東 濰坊 261053

牛娜