汪水平 楊大盛 李艷莎 姜仁輝 程春霞 莫念等 邱 浩

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶 402460）

近年來，植物及其提取物因其低毒副作用及所具有的天然性、多功能性和環(huán)保性，在動(dòng)物生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，以期替代抗生素。原花青素是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，屬于生物類黃酮大家族中的一員，由不同數(shù)量的兒茶素、表兒茶素或沒食子酸經(jīng)C4～C6或C4～C8鍵縮合而成［1］。它廣泛分布于植物界，在許多植物的根、莖、葉、花及果實(shí)中均含量豐富，其中以葡萄籽含量最高［2］。原花青素潛在抗氧化能力分別是維生素E和維生素C的20倍和50倍，具有非常強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基的活性［3］。同時(shí)，原花青素在保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、預(yù)防與治療糖尿病、防癌抗癌、抗炎癥、防治胃腸道潰瘍、抑制病原微生物、改善免疫抑制、改善微循環(huán)及保護(hù)皮膚等方面均具有一定藥理作用，是發(fā)達(dá)國(guó)家最受歡迎的植物藥之一［4］?？梢?，原花青素藥理學(xué)特性獨(dú)特，資源豐富，具有開發(fā)成抗生素替代品的潛力。目前，原花青素已被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥品及化妝品等領(lǐng)域。在美國(guó)，原花青素列入了食品添加劑目錄，并經(jīng)美國(guó)食品與藥品管理局認(rèn)定為“Generally Recognized as Safe”［5］。不過，將原花青素作為飼料添加劑在動(dòng)物生產(chǎn)中使用的研究報(bào)道很少?；诖?，本試驗(yàn)以葡萄籽提取物原花青素（grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE）為試驗(yàn)材料，通過給生長(zhǎng)期新西蘭兔飼喂GSPE添加量不同的飼糧，借助對(duì)抗氧化功能、脂質(zhì)含量及血清代謝產(chǎn)物濃度的考察，評(píng)估GSPE的應(yīng)用效果，試圖闡明其作用機(jī)理，為其在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

GSPE：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，提取自葡萄（Vitis vinifera L.）籽，為紅棕色粉末，氣微、味澀，純度不少于95%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用128只60日齡、體重相近的建康新西蘭兔作為試驗(yàn)動(dòng)物，公母各50%。采用單因子隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將128只新西蘭兔隨機(jī)分為4組（1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組），每組32個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，3個(gè)試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加100、200及400 mg／kg GSPE的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期為39 d，其中預(yù)試期為6 d，正試期為33 d。試驗(yàn)組肉兔在預(yù)試期內(nèi)由基礎(chǔ)飼糧逐漸過渡到試驗(yàn)飼糧。

1.3 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參考 NRC［6］和 de Blas［7］推薦的生長(zhǎng)兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。所有飼料原料過1.5 mm篩粉碎，按不同組別分別混勻，再采用冷制粒工藝制成直徑為4 mm的顆粒料，65℃烘干，用塑料袋密封，常溫保存待用。

表1 基礎(chǔ)飼糧的組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2012年3月13日到2012年4月20日在重慶市榮昌縣西南大學(xué)榮昌校區(qū)“7+5”肉兔養(yǎng)殖創(chuàng)業(yè)組進(jìn)行。兔舍為2層雙列式，每籠飼養(yǎng)1只。采用顆粒料飼喂，自由采食與飲水，日喂2次（07：00和18：00），每次投料少量多添，每次投料時(shí)間不得少于2 h。兔舍自然采光，自然通風(fēng)，日打掃衛(wèi)生1次，保持兔舍清潔衛(wèi)生。經(jīng)測(cè)定，試驗(yàn)期兔舍內(nèi)溫度平均為18.30℃，相對(duì)濕度平均為75.17%，溫濕指數(shù)平均為63.66。試驗(yàn)期間，按兔場(chǎng)規(guī)定進(jìn)行防疫、驅(qū)蟲和消毒，并密切觀察試驗(yàn)兔行為，發(fā)現(xiàn)異常立即處理。

1.5 樣品采集及預(yù)處理

1.5.1 血液樣品采集及預(yù)處理

在正式期結(jié)束的第2天，從每組中挑選16只接近各組平均體重的試驗(yàn)兔，晨飼前心臟采血16 mL，室溫斜置靜放1～2 h，3 000 r／min低溫離心15 min，得血清-80℃下保存待測(cè)。使用貝克曼庫(kù)爾特SYNCHRON CX5 PRO全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清代謝產(chǎn)物濃度。其中，葡萄糖（glucose，Glu）采用己糖激酶終點(diǎn)法，尿素氮（urea nitrogen，UN）采用脲酶 UV法，尿酸（uric acid，UA）采用重組尿酸氧化酶法，三酰甘油（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TCHO）采用GPO-PAP法?？偪寡趸芰Γ╰otal antioxidative capacity，T-AOC）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）與谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性及丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）濃度等血清抗氧化功能參數(shù)均按購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒上提供的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2 背最長(zhǎng)肌樣品采集及預(yù)處理

采血后的試驗(yàn)兔采用耳緣靜脈注射空氣法致死，盡可能取同側(cè)背最長(zhǎng)肌的同一部位，立即按照GB／T 6433—2006直接測(cè)定粗脂肪（ether extract，EE）含量，并按試劑盒上提供的方法，制備10%勻漿，再測(cè)定 T-AOC、T-SOD與 GSH-Px活性及MDA濃度等抗氧化功能參數(shù)。

1.5.3 肝臟樣品采集及預(yù)處理

盡可能取肝臟的同一部位，立即按照 GB／T 6433—2006直接測(cè)定EE含量，并按試劑盒上提供的方法，制備10%勻漿，再測(cè)定 T-AOC、T-SOD與GSH-Px活性及MDA濃度等抗氧化功能參數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)基本處理用Excel2003軟件進(jìn)行，結(jié)果采用SPSS 11.5軟件中的GLM模塊進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，多重比較用Duncan法，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)兔背最長(zhǎng)肌、肝臟及血清抗氧化功能參數(shù)

由表2可知，隨飼糧中GSPE添加量升高，試驗(yàn)兔背最長(zhǎng)肌、肝臟及血清T-AOC、T-SOD與GSHPx活性均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）升高，而MDA濃度極顯著（P＜0.01）降低。

表2 試驗(yàn)兔背最長(zhǎng)肌、肝臟及血清抗氧化功能參數(shù)

表2 （續(xù)）

2.2 試驗(yàn)兔背最長(zhǎng)肌、肝臟及血清脂質(zhì)含量

由表3可知，對(duì)照組試驗(yàn)兔背最長(zhǎng)肌EE含量極顯著（P＜0.01）高于 200 mg／kg組和400 mg／kg組，而肝臟EE含量、血清TG與TCHO濃度均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于其余3組。

表3 試驗(yàn)兔背最長(zhǎng)肌、肝臟及血清脂質(zhì)含量

2.3 試驗(yàn)兔血液指標(biāo)

由表4可知，對(duì)照組試驗(yàn)兔血清GLU與UN濃度均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于其余3組，而UA濃度顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）低于200 mg／kg組和400 mg／kg組。

表4 試驗(yàn)兔代謝產(chǎn)物濃度

3 討論

3.1 GSPE對(duì)肉兔抗氧化功能的影響

自由基具有強(qiáng)大的氧化能力。機(jī)體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)極為復(fù)雜，包括酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，其中以酶系統(tǒng)為主。酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶、GSHPx、過氧化氫酶及過氧化物酶等，非酶系統(tǒng)主要包括維生素類抗氧化劑、微量元素及谷胱甘肽等，兩者一起協(xié)同防止自由基的蓄積。由于苯酚羥基基團(tuán)的存在，可為脂肪氧化第一步產(chǎn)生的過氧化物基團(tuán)提供氫，故GSPE具有極強(qiáng)的抗氧化活性，能有效清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，從而緩解氧自由基的毒害，是一種高效的自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑［8］。并且，GSPE的其他生理功能，主要基于其抗氧化活性［9］。GSPE可通過直接猝滅自由基、改善機(jī)體抗氧化酶的活性及螯合金屬離子以形成惰性化合物而發(fā)揮其抗氧化的生理功能，還可再生維生素C、維生素E等抗氧化劑［10］。本試驗(yàn)中，飼糧添加GSPE，試驗(yàn)兔背最長(zhǎng)肌、肝臟及血清的T-SOD與GSH-Px活性得到提高，T-AOC得到改善，而 MDA得到降低，表明GSPE對(duì)肉兔具有抗氧化作用，且效果隨添加量升高而提高。

3.2 GSPE對(duì)肉兔脂質(zhì)代謝的影響

GSPE對(duì)機(jī)體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用已被證實(shí)。GSPE可降低血清和肝臟中總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白膽固醇含量，提高血清卵磷脂膽固醇脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性，加速膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)膽固醇的肝臟代謝，增加糞膽汁酸的排泄，從而間接增加膽固醇的體外排出。Pajuelo等［11］報(bào)道，給進(jìn)食高膽固醇飼料的大鼠飼喂GSPE，能阻止血清低密度脂蛋白膽固醇的升高和高密度脂蛋白膽固醇的降低，也能抑制肝臟EE與TCHO含量的增加，還能促進(jìn)類脂和膽固醇經(jīng)糞便的排瀉，提示GSPE具有降低體內(nèi)膽固醇的潛力。王淑娥等［12］將40只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（飼喂普通飼料）、高脂模型組（飼喂高脂飼料）及GSPE組（飼喂高脂飼料的同時(shí)，按每g體重0.2和0.6 mg的標(biāo)準(zhǔn)添加GSPE），飼喂20周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSPE組小鼠眼球血清TCHO和TG濃度升高的幅度較高脂模型組明顯減少，提示GSPE對(duì)高脂膳食致小鼠血脂升高有一定的阻抑作用。凌智群等［13］發(fā)現(xiàn)，在高脂飼料中添加100和400 mg／kg蓮房提取物原花青素，均可有效降低肝臟和血清中TCHO和TG含量，明顯升高血清高密度脂蛋白膽固醇濃度，降低血清低密度脂蛋白膽固醇濃度。本試驗(yàn)中，飼料添加 GSPE，可顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）降低試驗(yàn)兔背最長(zhǎng)肌和肝臟EE含量及血清TG和TCHO濃度，表明GSPE可降低肉兔組織和血液的脂質(zhì)含量，調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝，這與上述研究結(jié)果一致。

3.3 GSPE對(duì)肉兔血清代謝產(chǎn)物濃度的影響

血液是機(jī)體運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的載體，也是實(shí)現(xiàn)體液調(diào)節(jié)的途徑。因此，血清代謝產(chǎn)物是反映機(jī)體全身或局部代謝變化和組織生理功能的較為敏感的指標(biāo)。GLU作為重要的營(yíng)養(yǎng)性單糖，是機(jī)體代謝活動(dòng)快速應(yīng)變需能的最有效營(yíng)養(yǎng)素，是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織、胎兒生長(zhǎng)發(fā)育及乳腺等代謝的唯一能源［14］。血液GLU濃度的相對(duì)恒定對(duì)維持機(jī)體正常的生理功能具有十分重要的作用，機(jī)體的某些病理狀態(tài)能引起糖代謝障礙，使GLU濃度過高或過低，進(jìn)而引起各種疾病，甚至危及生命?；趯?duì)胰島素敏感細(xì)胞系的胰島素樣作用與抗氧化活性，GSPE能改善糖尿病狀態(tài)的氧化形式，可用于預(yù)防和治療糖尿病［15］。Bao-ing Li等［16］報(bào)道，給鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠口服 GSPE，可降低血液GLU、糖基化血紅蛋白及糖基化終產(chǎn)物的濃度，若同時(shí)注射低劑量胰島素，作用效果會(huì)明顯增強(qiáng)。謝文利等［17］發(fā)現(xiàn)，原花青素可明顯降低糖尿病大鼠血清GLU濃度，提高正常大鼠糖耐量。Schafer等［18］認(rèn)為，臨床中觀察到的口服松樹皮提取物原花青素后對(duì)糖尿病患者的血液GLU降低作用與原花青素抑制α-糖苷酶有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GSPE可降低肉兔血清GLU濃度，這與上述研究結(jié)果一致。不過，飼糧中GSPE的添加量與試驗(yàn)兔血清GLU濃度降低的程度關(guān)系不大，說明GSPE的安全性非常高，不會(huì)影響機(jī)體維持正常生理功能所需的GLU濃度。血液中非蛋白氮主要是蛋白質(zhì)代謝的中間或終末產(chǎn)物，包括UN、UA、肌酸、肌酐、膽紅素和氨等。汪水平等［19］認(rèn)為，血清UN濃度直接反映了動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝狀況，蛋白質(zhì)代謝良好時(shí)，UN濃度會(huì)降低。王文娟等［20］指出，血清UN濃度可較準(zhǔn)確地反映動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸之間的平衡狀況，氨基酸平衡良好時(shí)血清UN濃度會(huì)降低。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)兔血清UN濃度隨飼糧中GSPE添加量的升高而降低，表明GSPE能在一定程度上改善肉兔對(duì)含氮物質(zhì)的利用效率。林榮海等［21］和陳佳銘等［22］發(fā)現(xiàn)，原花青素可促進(jìn)血紅蛋白與血清蛋白的合成，具有抗貧血和改善蛋白質(zhì)代謝的作用，從而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用效率，這與本試驗(yàn)結(jié)果相近。UA是蛋白質(zhì)和核酸的一種代謝產(chǎn)物，高濃度的UA會(huì)沉積在動(dòng)物的關(guān)節(jié)處，引起痛風(fēng)，也會(huì)引起高血壓等相關(guān)疾病，但是UA也是一種極強(qiáng)的抗氧化劑，能減輕自由基對(duì)蛋白質(zhì)、DNA及膜脂質(zhì)的損害，從而達(dá)到抗衰老、抗癌等作用［23］。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)兔血清 UA濃度隨飼糧中GSPE添加量的升高而升高，這可能是在GSPE影響下機(jī)體抗氧化能力提高的一種表現(xiàn)。

4 結(jié)論

飼糧中添加200與400 mg／kg GSPE，肉兔背最長(zhǎng)肌EE含量極顯著（P＜0.01）降低，而血清UA濃度顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）升高。飼糧中添加100、200及400 mg／kg GSPE，肉兔背最長(zhǎng)肌、肝臟及血清 MDA濃度、肝臟 EE含量、血清 TG、TCHO、GLU及 UN濃度顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）降低，而背最長(zhǎng)肌、肝臟及血清T-AOC、T-SOD與GSH-Px活性顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）升高。

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