謝 濤 曾紅華， 汪 婕， 易翠平

（湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院1，湘潭 411104）

（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院2，長沙 410015）

微生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在健康人體消化道內(nèi)有細(xì)菌約500多種，其數(shù)量達(dá)100兆以上，其中雙歧桿菌是腸內(nèi)最有益的菌群，可以預(yù)防便秘、防治心血管疾病，增強(qiáng)免疫力等［1］。由于益生元可以促進(jìn)體內(nèi)雙歧桿菌等益生菌的增長，有益于人體腸道健康，因此對于益生元的研究也越來越多?？剐缘矸圩鳛橐环N新型的益生元制劑，具有來源廣泛、制備工藝簡單、口感好等優(yōu)點(diǎn)，在國外已被廣泛研究［2-4］。Morais等［5］研究了抗性淀粉對豬腸道吸收鈣、鐵、鋅離子的影響，結(jié)果表明，抗性淀粉明顯促進(jìn)了豬腸道對鈣離子和鐵離子的吸收。Bird等［6］證實(shí)抗性淀粉有助于短鏈脂肪酸的生成，影響腸道細(xì)菌的生長。Cummings等［7］研究抗性淀粉在人體大腸的消化和生理特性，結(jié)果表明抗性淀粉增加了糞便濕重，促進(jìn)了短鏈脂肪酸的生成，而且大部分抗性淀粉在大腸內(nèi)被消化吸收。Yamada等［8］研究富含抗性淀粉的面包對人體餐后血糖的影響，結(jié)果顯示富含抗性淀粉的面包具有預(yù)防糖尿病，可以作為一個(gè)有效的食療方法。本研究采用體外模擬試驗(yàn)對綠豆、馬鈴薯、錐栗和板栗抗性淀粉的益生作用及結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，以期將這幾種抗性淀粉成功開發(fā)為新一代益生元產(chǎn)品打下重要的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)，填補(bǔ)國內(nèi)在這方面的研究空白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選擇性培養(yǎng)基：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（大腸桿菌）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（雙歧桿菌）、LAMVAB瓊脂培養(yǎng)基（乳酸桿菌）、麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基（糞腸球菌）、亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（梭狀桿菌）、甘露醇瓊脂培養(yǎng)基（產(chǎn)氣莢膜梭菌）、需氧-厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基：美國Life Tech公司；耐熱α-淀粉酶、糖化酶：Sigma公司。

Flash GO自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀：西班牙IUL公司；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；S-570型掃描電子顯微鏡：日本日立公司；D／max2500全自動(dòng)X射線衍射儀：日本理學(xué)株式會(huì)社；DSC200型差示掃描量熱分析儀：德國NETZSCH公司。

1.2 抗性淀粉制備

制備［9］：用蒸餾水配制30%的淀粉乳液，調(diào)節(jié)pH為6.0，沸水浴30 min后，121℃高溫高壓處理40 min。冷卻，4℃放置24 h。重復(fù)高溫高壓和冷卻步驟，80℃烘干，粉碎過100目篩得粗抗性淀粉。

純化［10］：取粗抗性淀粉用耐熱 α-淀粉酶在70℃水解1 h，加入過量糖化酶，55℃水解2 h，離心（3 000 r／min，30 min），水洗離心多次，最后用 95%乙醇清洗，干燥，粉碎，過200目篩，得純抗性淀粉，供試驗(yàn)用。

1.3 培養(yǎng)基

MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，肉膏10 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.189 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.2～6.6。

改良MRS培養(yǎng)基：以2%的抗性淀粉取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源，不加抗性淀粉為對照。

選擇性培養(yǎng)基：見1.1。

1.4 體外厭氧發(fā)酵

取年齡23～31歲健康男子（此前至少3個(gè)月以上未注射抗生素，沒有預(yù)先服用已知的益生元或益生菌，沒有胃腸病史）的糞便，將糞便用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）制成均勻的懸浮液。

取4×3個(gè)50 mL的錐形瓶，設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)裝入20 mL改良MRS培養(yǎng)基，于121℃，1×105Pa滅菌20 min后，每個(gè)錐形瓶接入等量已多次用MRS培養(yǎng)基活化的糞便培養(yǎng)物，密封，37℃厭氧培養(yǎng)至10、20、30 h分別取樣，用于腸道微生物菌群組成和總酸度的測定分析。

1.5 腸道菌群組成分析

取樣品液1 mL，用生理鹽水稀釋一定倍數(shù)后涂布于選擇性平板上，于37℃需／厭氧培養(yǎng)48～72 h后，使用全自動(dòng)菌落分析儀計(jì)數(shù)。

1.6 發(fā)酵液總酸度的測定

參照GB／T 12456—1990測定每份發(fā)酵液的總酸度，并以乳酸含量表示。

1.7 抗性淀粉及發(fā)酵殘余物結(jié)構(gòu)測定

取10mL發(fā)酵液，離心（15 min，3 000 r／min），沉淀用10 mL蒸餾水清洗3次后烘干，粉碎過100目篩，這些發(fā)酵殘余物稱為發(fā)酵抗性淀粉。采用碘吸收法［11］測定發(fā)酵前后抗性淀粉的平均聚合度，掃描電子顯微（SEM）分析采用參考文獻(xiàn)［12］的方法；X-射線衍射（XRD）分析采用參考文獻(xiàn)［13］的方法。

所有數(shù)據(jù)為3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，且采用SPSS 20.0 for windows進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性淀粉對腸道菌群生長的影響

以不添加抗性淀粉為對照，在體外厭氧發(fā)酵至10、20、30 h取樣，測定4種抗性淀粉對腸道菌群生長的影響，結(jié)果見表1。除大腸桿菌在取樣的3個(gè)時(shí)刻都受到強(qiáng)烈的抑制外，其余6個(gè)菌株發(fā)酵至10 h時(shí)菌濃并未出現(xiàn)大的變化、當(dāng)發(fā)酵至20 h時(shí)菌濃均達(dá)到最大。發(fā)酵至30 h時(shí)7個(gè)菌株的菌濃均比發(fā)酵至20 h時(shí)的低，這是由于30 h時(shí)細(xì)菌生長已達(dá)衰老期，導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)目減少。由表1還可知，4種抗性淀粉對雙歧桿菌和乳酸桿菌都有較好的增殖作用，對大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌有明顯的抑制作用，對糞腸球菌、梭狀桿菌、兼性細(xì)菌無明顯影響。

值得注意的是，與參考文獻(xiàn)［9］中報(bào)道的單菌培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果相比，在腸道微生物混合培養(yǎng)試驗(yàn)中，4種抗性淀粉對其中益生菌的增殖作用出現(xiàn)明顯降低，而對大腸桿菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。這些現(xiàn)象表明腸道微生物菌群之間會(huì)相互影響，抗性淀粉對某一細(xì)菌的增殖／抑制不代表在腸道中就一定會(huì)增殖／抑制此菌的生長，它們對腸道微生物菌群的影響與腸道中特定的微環(huán)境密切相關(guān)。

表1 幾種抗性淀粉對腸道菌群生長的影響／lg CFU／mL

2.2 發(fā)酵液的酸度分析

發(fā)酵液的總酸度在一定程度上代表了益生菌尤其是雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖情況，雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖會(huì)促進(jìn)丙酸、丁酸、乳酸等合成［14］。表2為添加不同抗性淀粉發(fā)酵10、20、30 h所測得的總酸度（以乳酸值表示）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，各種抗性淀粉的發(fā)酵液總酸度有所增大，且4種抗性淀粉的發(fā)酵液總酸度均比對照值要高，說明4種抗性淀粉被腸道益生菌發(fā)酵利用過程中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸數(shù)量增多，這與文獻(xiàn)［15］的報(bào)道一致。

表2 幾種抗性淀粉發(fā)酵液的總酸度（以乳酸表示，g／L））

2.3 發(fā)酵后抗性淀粉的超微結(jié)構(gòu)變化

圖1為綠豆、馬鈴薯、錐栗和板栗抗性淀粉經(jīng)腸道菌群發(fā)酵30 h后的掃描電鏡圖。比較圖1a1與圖1a2、圖1b1與圖1b2可看出，綠豆和馬鈴薯抗性淀粉表面的薄片大小不一，且分布稀散，表層以下的主體結(jié)構(gòu)裸露；而發(fā)酵后綠豆和馬鈴薯抗性淀粉表面的片層結(jié)構(gòu)大小變得更為均勻，且其堆積方式變得更加整齊，密度增大，完全覆蓋在表面。同樣，與發(fā)酵前的錐栗和板栗抗性淀粉（圖1c1、圖1d1）相比，由圖1c2、圖1d2也可看出，發(fā)酵后錐栗和板栗抗性淀粉的表面由原來單一的薄片層結(jié)構(gòu)變?yōu)橛善瑢?、薄片與纖絲混合堆積的結(jié)構(gòu)，但發(fā)酵后錐栗抗性淀粉表面結(jié)構(gòu)中薄片比例較高，而發(fā)酵后板栗抗性淀粉的纖絲狀結(jié)構(gòu)比例較高。因此，經(jīng)體外厭氧發(fā)酵后，抗性淀粉的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化，結(jié)構(gòu)變得更加有序，比表面積增加。

2.4 發(fā)酵抗性淀粉的平均聚合度變化

4種抗性淀粉經(jīng)腸道微生物發(fā)酵30 h后直鏈淀粉的含量及其平均聚合度見表3。從表3可以看出，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后抗性淀粉的直鏈淀粉含量稍有增加，而其平均聚合度有所降低，但不及抗性淀粉較之原淀粉平均聚合度的降幅明顯。

2.5 發(fā)酵后抗性淀粉的結(jié)晶度變化

淀粉是主要由A型和B型晶體及少量V型晶體組成的混合物。Lopez-Rubio等［16］研究表明，A型晶體通常 2θ為 17.14°、18.14°、15.11°和 26.27°出現(xiàn)強(qiáng)的特征衍射峰，另外 2θ為 9.98°、11.19°、22.93°、23.68°、30.30°和 33.08°也有衍射峰；B型晶體2θ為5.51°、14.60°和 16.85°具有典型衍射峰，以及 2θ為 10.01°、11.02°、13.85°、22.30°、23.71°、26.16°、30.61°和 33.84°也出現(xiàn)衍射峰；V型晶體在2θ＝19.80°處出現(xiàn)標(biāo)志性衍射峰，有時(shí)2θ為7.40°和12.90°也有衍射峰。圖2為綠豆、馬鈴薯、錐栗和板栗的抗性淀粉和發(fā)酵抗性淀粉的廣角X射線衍射圖譜，由圖譜得到其結(jié)晶參數(shù)見表4。從圖2和表4中可以看出，綠豆、馬鈴薯抗性淀粉為B型晶體，B型晶體所占比例較高；錐栗、板栗抗性淀粉的晶型為V型，V型晶體所占比例較高。綠豆、馬鈴薯、錐栗和板栗抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，它們的晶型均變?yōu)锳型，以A型晶體為主，亞微晶比例基本穩(wěn)定在17%左右（數(shù)據(jù)未列出），而微晶比例明顯降低，說明發(fā)酵作用對抗性淀粉的微晶有較大影響。

圖2 幾種抗性淀粉發(fā)酵前后的X-射線衍射圖譜

表4 幾種抗性淀粉發(fā)酵前后的結(jié)晶參數(shù)／%

3 結(jié)論

3.1 4 種抗性淀粉對雙歧桿菌和乳酸桿菌都有較好的增殖作用，對大腸桿菌有明顯的抑制作用，對產(chǎn)氣莢膜梭菌有較強(qiáng)的抑制作用，對糞腸球菌、梭狀桿菌、兼性細(xì)菌無明顯影響。4種抗性淀粉的發(fā)酵液總酸度增大，說明它們被腸道益生菌發(fā)酵利用產(chǎn)生了更多的短鏈脂肪酸。

3.2 發(fā)酵后綠豆和馬鈴薯抗性淀粉表面的片層結(jié)構(gòu)大小變得更為均勻，且其堆積方式變得更加整齊，密度增大，完全覆蓋在表面。同樣，發(fā)酵后錐栗和板栗抗性淀粉的表面由原來單一的薄片層結(jié)構(gòu)變?yōu)橛善瑢?、薄片與纖絲混合堆積的結(jié)構(gòu)。

3.3 綠豆、馬鈴薯抗性淀粉為B型晶體，錐栗、板栗抗性淀粉的晶型為V型。發(fā)酵后4種抗性淀粉的平均聚合度有所降低，它們的晶型均變?yōu)锳型，以A型晶體為主，微晶度降低。

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