鄭志民 ,周壽紅 ,胡 弼

(1.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥理學(xué)教研室,湖南永州425006;2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室)

女性絕經(jīng)后阿爾茨海默病的發(fā)病率明顯上升, 普遍認(rèn)為主要與女性絕經(jīng)后雌激素水平顯著降低有關(guān)[1]。使用雌激素替代療法導(dǎo)致女性部分生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢[2],故臨床使用尚有爭議。羅格列酮是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptor-γ,PPAR-γ)人工合成的激動藥。近幾年研究發(fā)現(xiàn),羅格列酮能改善多種原因引起的動物學(xué)習(xí)記憶障礙[3-4],羅格列酮能提高阿爾茨海默病患者的學(xué)習(xí)記憶能力[5-6]。而羅格列酮對于去卵巢大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型影響的研究還未見報(bào)道,故本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)卵巢摘除術(shù)(ovariectomy,OVX)制備去卵巢大鼠模型,研究羅格列酮對去卵巢大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)TNF-α和IL-6表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

羅格列酮購于浙江萬馬藥業(yè)有限公司;TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購于RD公司。Morris水迷宮裝置由南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室提供;Hema TGL-18R型冷凍離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組 健康清潔級雌性SD大鼠56只,體量230～280 g,由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物部提供;大鼠常規(guī)飼養(yǎng)4天后,隨機(jī)將56只SD大鼠分為假手術(shù)對照組(sham control group,SC組)、去卵巢組(ovariectomized group,OV組)、假手術(shù)+羅格列酮組(sham control+rosiglitazone group,SC+R組)、去卵巢+羅格列酮組(ovariectomized+rosiglitazone group,OV+R組),每組14只。均以普通飼料喂養(yǎng),自由飲水。

1.2.2 動物模型制備 各組經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉后,仰面固定,腹正中切口,沿子宮雙角找到雙側(cè)卵巢并充分暴露,OV及OV+R組大鼠切除雙側(cè)卵巢,SC及SC+R組則不切除卵巢,分層縫合。

1.2.3 治療方法 術(shù)后一周,刀口愈合,飲食正常,無肢體殘疾,開始灌胃給藥。共進(jìn)行13周,OV+R組給予羅格列酮(5 mg/kg/d)[7],OV及SC組給予等體積生理鹽水。

1.2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 術(shù)后15周進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。水迷宮直徑80 cm,高40 cm,分為4個象限,第三象限放置一圓柱形透明玻璃站臺,高25.5 cm,直徑12 cm。站臺置于水下0.5 cm,水溫(25±1)℃,實(shí)驗(yàn)期間保持環(huán)境安靜。采用Morris水迷宮圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)的采集和處理。

1.2.5 定位航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4天,每天進(jìn)行4次,每次采用不同象限入水,每次訓(xùn)練70 s。大鼠如在70 s內(nèi)找到平臺并停留3 s,則訓(xùn)練結(jié)束,記錄其找到平臺的時間為潛伏期;如70 s內(nèi)未找到平臺,則將大鼠牽引到平臺停留10 s,記錄潛伏期為70 s;計(jì)算大鼠每日由第三象限下水找到平臺的平均潛伏期。

1.2.6 空間探索實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)第5天,撤去平臺,選擇第三象限作為下水點(diǎn),記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺區(qū)域次數(shù)為穿越目標(biāo)次數(shù);記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺區(qū)域時間為穿越目標(biāo)時間。

1.2.7 大鼠海馬組織中TNF-α和IL-6水平檢測Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后,各組大鼠休息2天。術(shù)后16周斷頭處死大鼠,冰上迅速剖腦,分出海馬,稱重后加入預(yù)先冰凍的少量酸化正丁醇的玻璃勻漿器中,研磨制成勻漿,3500 r/min離心15 min,取上清,用ELISA酶聯(lián)免疫法檢測TNF-α和IL-6水平,操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 羅格列酮對去卵巢大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行比較。結(jié)果如表1所示：各組大鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)增加,尋找平臺的潛伏期明顯縮短;與SC組比較,OV組大鼠尋找平臺的潛伏期明顯延長(P＜0.01),穿越目標(biāo)次數(shù)明顯減少(P＜0.01),穿越目標(biāo)時間明顯縮短(P＜0.01);與OV組比較,OV+R組大鼠尋找平臺的潛伏期明顯縮短(P＜0.01),穿越目標(biāo)次數(shù)明顯增加(P＜0.01),穿越目標(biāo)時間明顯延長(P＜0.01)。

2.2 羅格列酮對去卵巢大鼠海馬組織中TNF-α和IL-6表達(dá)的影響

如表2所示,與SC組比較,OV組大鼠海馬組織TNF-α和IL-6表達(dá)明顯升高(P＜0.01);與OV組比較,OV+R組大鼠海馬組織TNF-α和IL-6表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。

表1 羅格列酮對去卵巢大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(n=14)

表2 各組大鼠海馬組織TNF-α、IL-6表達(dá)(n=14)

3 討 論

去卵巢大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型是經(jīng)典的研究絕經(jīng)后女性阿爾茨海默病的動物模型。本實(shí)驗(yàn)中我們采用雙側(cè)卵巢摘除術(shù)制備去卵巢大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型,通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證明大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降,說明本實(shí)驗(yàn)建模成功。

越來越多的臨床和實(shí)驗(yàn)證明,阿爾茨海默病與慢性炎癥存在重要聯(lián)系。炎癥因子參與了阿爾茨海默病神經(jīng)炎癥損傷的病理過程[8]。阿爾茨海默病患者死后,尸體病理解剖發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)炎癥因子表達(dá)明顯升高[9]。阿爾茨海默病患者血漿中TNF-α和IL-6水平明顯高于健康對照者[10-11]。體內(nèi)TNF-α的高表達(dá)能加速阿爾茨海默病患者的認(rèn)知損傷[12]。

女性絕經(jīng)后阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率明顯升高,普遍認(rèn)為與卵巢萎縮導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平明顯下降有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),去卵巢獼猴頸動脈TNF-α、IL-6等炎癥因子表達(dá)明顯升高,氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng),補(bǔ)充雌激素能降低去卵巢獼猴頸動脈TNF-α和IL-6等炎癥因子表達(dá)和氧化應(yīng)激[13];老齡小鼠體內(nèi)雌激素水平、活性明顯下降,導(dǎo)致小鼠神經(jīng)炎癥明顯增強(qiáng)[14]。上述實(shí)驗(yàn)說明雌激素具有一定抗炎癥和抗氧化應(yīng)激作用,而女性絕經(jīng)后因?yàn)轶w內(nèi)雌激素水平下降導(dǎo)致雌激素上述作用減弱,引起女性絕經(jīng)后神經(jīng)炎癥及氧化應(yīng)激增強(qiáng),這可能是女性絕經(jīng)后阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率明顯上升的原因。本實(shí)驗(yàn)中我們用ELISA法檢測去卵巢大鼠大腦海馬區(qū)TNF-α和IL-6的表達(dá),結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較,去卵巢大鼠組海馬區(qū)TNF-α和IL-6的表達(dá)顯著升高(P＜0.01),與以往研究相符。

羅格列酮是人工合成的PPAR-γ激動藥,是經(jīng)典的胰島素增敏藥,本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),羅格列酮能改善去卵巢大鼠的胰島素抵抗[15]。PPAR-γ屬于細(xì)胞核受體,是一種配體激活型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn),PPAR-γ對神經(jīng)退行性疾病中細(xì)胞具有保護(hù)作用[16]。激動PPAR-γ能抑制巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6的產(chǎn)生,抑制多種炎癥因子的表達(dá)[17]。羅格列酮能降低糖尿病大鼠血清中TNF-α和IL-6、c-反應(yīng)蛋白的表達(dá)[18]。羅格列酮能改善腦局灶缺血小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[19]。羅格列酮能降低大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織中炎癥因子TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)水平[20]。本實(shí)驗(yàn)中,與SC組比較,OV組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低,腦部海馬區(qū)TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)明顯升高;與OV組比較,OV+R組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高,腦部海馬區(qū)TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)顯著降低,說明羅格列酮能改善去卵巢大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙,其機(jī)制可能與其降低去卵巢大鼠海馬TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1]楊華,屈秋明,郭峰,等.雌激素在阿爾茨海默病患者的改變及其意義[J].中國神經(jīng)精神病雜志,2007,33(3)：179-182.

[2]Alexander IM.The history of hormone therapy use and recent controversy related to heart disease and breast cancer arising from prevention trial outcomes[J].J Midwifery Womens Health,2012,57(6)：547-557.

[3]Rodriguez-Rivera J,Denner L,Dineley KT.Rosiglitazone reversal of Tg2576 cognitive deficits is independent of peripheral gluco-regulatory status[J].Behav Brain Res,2011,216(1)：255-261.

[4]Escribano L,Simón AM,Pérez-Mediavilla A,et al.Rosiglitazone reverses memory decline and hippocampal glucocorticoid receptor down-regulation in an Alzheimer's disease mouse model[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,379(2)：406-410.

[5]Risner ME,Saunders AM,Altman JF,et al.Efficacy of rosiglitazone in a genetically defined population with mildto-moderate Alzheimer's disease[J].Pharmacogenomics J,2006,6(4)：246-254.

[6]Watson GS,Cholerton BA,Reger MA,et al.Preserved cognition in patients with early Alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment during treatment with rosiglitazone：a preliminary study[J].Am J Geriatr Psychiatry,2005,13(11)：950-958.

[7]文金生,胡弼,龍光,等.羅格列酮對果糖飼養(yǎng)大鼠血糖血脂及血管重構(gòu)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2004,20(5)：571-575.

[8]Richardson C,Gard PR,Klugman A,et al.Blood pro-inflammatory cytokines in Alzheimer's disease in relation to the use of acetylcholinesterase inhibitors[J].Int J Geriatr Psychiatry,2013,28(12)：1312-1317.

[9]Iwamoto N,Nishiyama E,Ohwada J,et al.Demonstration of CRP immunoreactivity in brains of Alzheimer's disease：immunohistochemical study using formic acid pretreatment of tissue sections[J].Neurosci Lett,1994,177(1-2)：23-26.

[10]Helmy AA,Naseer MM,Shafie SE,et al.Role of interleukin 6 and alpha-globulins in differentiating Alzheimer and vascular dementias[J].Neurodegener Dis,2012,9(2)：81-86.

[11]Darreh-Shori T,Vijayaraghavan S,Aeinehband S,et al.Functional variability in butyrylcholinesterase activity regulates intrathecal cytokine and astroglial biomarker profiles in patients with Alzheimer's disease[J].Neurobiol Aging,2013,34(11)：2465-2481.

[12]Holmes C,Cunningham C,Zotova E,et al.Systemic inflammation and disease progression in Alzheimer disease[J].Neurology,2009,73(10)：768-774.

[13]Sophonsritsuk A,Appt SE,Clarkson TB,et al.Differential effects of estradiol on carotid artery inflammation when administered early versus late after surgical menopause[J].Menopause,2013,20(5)：540-547.

[14]Benedusi V,Meda C,Della Torre S,et al.A lack of ovarian function increases neuroinflammation in aged mice[J].Endocrinology,2012,153(6)：2777-2788.

[15]鄭志民,劉顯慶,周壽紅,等.羅格列酮通過上調(diào)脂肪脂聯(lián)素及其受體的表達(dá)改善去卵巢大鼠胰島素抵抗[J].中國動脈硬化雜志,2009(5)：383-386.

[16]Deplanque D.Cell protection through PPAR nuclear receptor activation[J].Therapie,2004,59(1)：25-29.

[17]Rigamonti E,Chinetti-Gbaguidi G,Staels B.Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha,PPAR-gamma,and LXRs in mice and men[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(6)：1050-1059.

[18]張曉菲,赫飛,楊景.羅格列酮對糖尿病大鼠血清炎性介質(zhì)和早期皮膚改變的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2010(10)：1016-1019.

[19]尚進(jìn)林,孫莉,梁浩,等.過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑對小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中華神經(jīng)科雜志,2009,42(3)：190-194.

[20]郭金濤,高甜,宋穎飛.PPARγ激動劑對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2008,11(2)：20-22.