唐國華 ,屈麗華

(1.南華大學(xué)生命科學(xué)研究中心,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室)

腎臟是人體重要的器官,不僅能分泌尿液、排泄代謝廢物,還具有調(diào)節(jié)血壓、體液平衡,以及骨骼密度的功能。全球有10%的慢性腎臟疾病患者進展為慢性腎功能不全、尿毒癥,是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一[1-2]。國內(nèi)外學(xué)者們一直致力于研究腎臟發(fā)育的分子機制,并試圖利用干細胞移植,修復(fù)腎臟損傷,重建終末期腎病患者腎臟的功能。

胚胎后腎間充質(zhì)細胞是一種多潛能干細胞,研究表明它能分化形成腎上皮細胞[3-4]。因此,利用后腎間充質(zhì)細胞移植治療很可能成為改善急性腎小管壞死預(yù)后的重要方法[4-5]。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是一類細胞因子,最早發(fā)現(xiàn)于小鼠KrebsⅡ腹水瘤細胞條件培養(yǎng)液中,能誘導(dǎo)白血病細胞株M1細胞向正常細胞分化[6]。已有研究報道LIF能誘導(dǎo)神經(jīng)前體細胞分化為星形膠質(zhì)細胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞及感覺神經(jīng)元[7-8];JAKSTAT信號介導(dǎo)的LIF受體激活是形成上皮小管所必需[9-10],提示LIF在細胞分化過程中具有重要作用。本文分離并鑒定后腎間充質(zhì)細胞,利用體外細胞培養(yǎng)技術(shù),在培養(yǎng)液中加入細胞因子LIF進行誘導(dǎo),用免疫熒光染色和RT-PCR檢測后腎間充質(zhì)細胞分化形成腎上皮細胞過程中的形態(tài)學(xué)和基因表達變化,旨在闡明后腎間充質(zhì)細胞分化形成上皮細胞過程中的生物學(xué)特性變化,理解腎臟發(fā)生和發(fā)育過程,為腎臟組織工程學(xué)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Balb/c小鼠(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司);兔多克隆抗體Pax2(1:250,Abcam),laminin α5(1:250,Abcam),anti-rabbit FITC(1:250,Santa Cruz);DMEM-LG培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清FBS(Gibco);胰酶(Amersco);轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor alpha,TGF-α)(10 ng/mL,Boehringer Mannheim),成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF 2)(50 ng/mL,Boehringer Mannheim)和白血病抑制因子LIF(10 units/mL,Chemicon);RNeasy Mini Kit(Qiagen);SupercriptⅡRNase H-Reverse Transcriptase(Invitrogen);引物(Invitrogen);VECTASHIELD Fluorescent Mounting Media(Vector Laboratories)。

1.2 方法

1.2.1 后腎間充質(zhì)細胞的分離和培養(yǎng) 取孕11.5天Balb/c雌鼠(以發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)日為受孕0.5天),斷頸處死,在解剖顯微鏡下剝離胎盤,獲取E11.5小鼠胚胎。未分化的后腎間充質(zhì)細胞位于胚胎后肢的后1/3處,即輸尿管的背側(cè),輸尿管芽向背部延伸處[11]。在小鼠前肢下方橫向剪斷,沿胚胎神經(jīng)管縱向剪開,截斷尾部;根據(jù)后腎位置及其形狀分離得到胚胎后腎間充質(zhì)組織,去除輸尿管芽 (圖1);將解剖分離后組織置于4℃預(yù)冷的DMEM清洗備用。

圖1 分離后腎間充質(zhì)組織解剖示意圖 A：沿虛線,即從胚胎前肢的下方橫向剪斷;B：沿神經(jīng)管縱向剪開,并截去尾部,使輸尿管暴露于視野下;C：未分化的后腎間充質(zhì)細胞(MM)位于胚胎后肢的后1/3處,即輸尿管芽向背部延伸處

1.2.2 后腎間充質(zhì)細胞的培養(yǎng)和分化誘導(dǎo) 將解剖分離的后腎組織在膠原酶溶液中(DMEM+10%FBS+0.2%膠原酶 +50 IU/mL DNase)37℃孵育15 min;殘存后腎組織以0.25%胰酶/0.02%EDTA(1:1)室溫消化至組織塊消失;加入含10%FBS的DMEM,1 000 r/min離心5 min;棄上清,含10%FBS的DMEM重懸細胞,細胞濃度調(diào)整至5×104/cm2,放入37℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別加入生長刺激因子 TGF-α(10 ng/mL)、FGF 2(50 ng/mL)和LIF(10 units/mL),以誘導(dǎo)后腎間充質(zhì)細胞分化形成腎上皮細胞[3,12-14]。

1.2.3 后腎間充質(zhì)細胞的鑒定 將解剖分離好的后腎間充質(zhì)組織或者涂有后腎間充質(zhì)細胞的玻片放在4%多聚甲醛固定20 min;PBST(0.2%的Triton X-100)處理10 min,增加膜的通透性;含1%BSA的PBS封閉15 min;加入一抗Pax2(1:250,Abcam)或laminin α5(1:250,Abcam)4℃孵育過夜;PBS洗 3次,每次5 min;加入熒光素標(biāo)記的二抗anti-rabbit FITC(1:250,Santa Cruz)室溫下避光孵育1 h;PBS洗3次,每次5min;防熒光淬滅封片劑(VECTASHIELD)固定,熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 RT-PCR分析 RNeasy Mini Kit試劑盒提取分離好的小鼠后腎間充質(zhì)細胞RNA(見試劑盒抽提方法);分光光度計(Nanodrop)檢測RNA的濃度和質(zhì)量;SupercriptⅡRNase H-Reverse Transcriptase合成cDNA(500ngRNA每個反應(yīng))。引物序列如下：

2 結(jié) 果

2.1 小鼠后腎間充質(zhì)組織的分離和鑒定

利用后腎間充質(zhì)細胞標(biāo)記基因Pax-2抗體,對解剖分離得到的后腎組織進行染色,免疫組化分析表明小鼠后腎間充質(zhì)組織定位正確(圖2)。

圖2 Pax2抗體鑒定后腎間充質(zhì)組織 A：普通光學(xué)顯微鏡觀察;B：熒光顯微鏡剝離E12.5胚胎中的后腎間充質(zhì)組織,兔多克隆抗體Pax2染色,表達陽性

2.2 后腎間充質(zhì)細胞的分化誘導(dǎo)

分離的后腎間充質(zhì)組織經(jīng)膠原酶和胰酶消化形成單一、懸浮的后腎間充質(zhì)細胞。用免疫熒光染色檢測上皮細胞基底膜極性蛋白laminin α5的表達情況。結(jié)果顯示：FGF2/TGF-α培養(yǎng)48 h,基底膜極性蛋白laminin α5不表達,細胞無極性且排列紊亂,表明細胞還未被誘導(dǎo)分化為上皮細胞(圖3A,3D)。加入LIF培養(yǎng)48 h,laminin α5蛋白開始表達,細胞成簇,具有頂端膜等上皮細胞的特點,細胞由原來的無規(guī)則排列增殖形成“S”或“C”型小體樣的鏈狀結(jié)構(gòu) (圖3B,3E)。LIF誘導(dǎo)1周后,細胞簇進一步發(fā)育形成具有連續(xù)基底膜包圍的腎小管或者腎小球結(jié)構(gòu)(圖3C,3F)。

RT-PCR結(jié)果顯示：加入FGF2、TGF-a培養(yǎng)48 h后,Wt1、Pax2和Wnt4等與細胞聚集形成相關(guān)的蛋白在后腎間充質(zhì)細胞中有表達,早期的上皮膠原蛋白CollagenⅣ在這個時期也有表達,而特異性上皮細胞標(biāo)記蛋白E-cadherin,laminin α5以及足細胞標(biāo)記蛋白podocalyxin不表達;加入LIF誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后,細胞粘性蛋白 E-cadherin以及基質(zhì)蛋白lamininα5開始表達,而足細胞的標(biāo)志蛋白podocalyxin則在誘導(dǎo)1周后,才有表達,標(biāo)志著腎小球開始形成(圖4)。

圖3 LIF誘導(dǎo)后腎間充質(zhì)細胞分化為上皮細胞的生物形態(tài)學(xué)變化 A-C：普通光學(xué)顯微鏡觀察;D-F：熒光顯微鏡.A,D：FGF2/TGF-a處理培養(yǎng)后腎間充質(zhì)細胞48 h,細胞呈不規(guī)則排列,laminin α5不表達;B,E：FGF2/TGF-a/LIF處理培養(yǎng)后腎間充質(zhì)細胞48 h,細胞呈鏈狀排列,伴隨著基質(zhì)膜蛋白laminin α5的表達;C,F：由基質(zhì)膜蛋白laminin α5包圍,細胞開始形成管狀和早期的腎小球結(jié)構(gòu)

3 討 論

后腎間充質(zhì)細胞是腎臟的多能干細胞,經(jīng)過間充質(zhì)-上皮細胞的分化過程,形成極性細胞,最終能分化為腎單位[3,15-16]。腎單位是腎臟的結(jié)構(gòu)和功能單位。因此,利用后腎間充質(zhì)細胞治療腎臟疾病成為國際研究焦點。

圖4 RT-PCR檢測后腎間充質(zhì)細胞分化形成上皮細胞過程中的基因表達變化

腎臟發(fā)育過程中,腎單位上皮細胞的形成是受各種不同細胞之間信號相互作用。該相互作用包括輸尿管芽、后腎間充質(zhì)細胞和腎基質(zhì)三者之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[16-21]。本實驗分離了上皮始祖細胞(即后腎間充質(zhì)細胞),直接采用上皮細胞發(fā)育所需的生長因子處理,使得復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)簡單化。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-a)和成纖維細胞生長因子(FGF)是保持細胞正常生長和增殖,并保證細胞分化為上皮細胞所必需的刺激因子。若無上述刺激因子,后腎間充質(zhì)細胞會出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象[22];加入FGF2/TGF-a處理,后腎間充質(zhì)細胞至少能存活1周以上,但并不能誘導(dǎo)分化形成上皮細胞[3,23]。而白血病抑制因子(LIF)是后腎間充質(zhì)細胞分化為腎上皮細胞所必需的因子[12,14]。本實驗中生長刺激因子作用對象為單一的上皮始祖細胞,排除了輸尿管芽或者腎基質(zhì)對后腎間充質(zhì)作用的干擾,研究了轉(zhuǎn)錄調(diào)控子(Pax-2,WT-1),細胞基質(zhì)蛋白 (E-cadherin,lamininα5,CollagenⅣ),糖蛋白(Podocalyxinn),信號分子(Wnt4)與腎上皮細胞各個發(fā)育階段之間的直接關(guān)系,解決了細胞示蹤技術(shù)不成熟這一難題。

本實驗利用LIF誘導(dǎo)單一后腎間充質(zhì)細胞的模型,對后腎間充質(zhì)分化為上皮細胞的生物學(xué)特性進行了研究。laminin α5免疫熒光染色結(jié)果顯示,無LIF處理,后腎間充質(zhì)細胞不能分化形成上皮細胞;加入LIF刺激,無規(guī)則排列的細胞增殖聚集 (圖3A,3D),形成“S”或“C”型小體樣的鏈狀結(jié)構(gòu) (圖3B,3E),進一步發(fā)育形成連續(xù)基底膜包圍的腎小管或者腎小球結(jié)構(gòu) (圖3C,3F)。本實驗還發(fā)現(xiàn),在TGF-a和 FGF誘導(dǎo)下,后腎間充質(zhì)細胞高表達Pax2、WT-1、Wnt4和CollagenⅣ,使得后腎間充質(zhì)細胞區(qū)別于其他間質(zhì)細胞[24-26]。CollagenⅣ的高表達標(biāo)志著后腎間充質(zhì)細胞已經(jīng)在向上皮細胞轉(zhuǎn)化[24]。但是E-cadherin,lamininα5,podocalyxin等細胞極性標(biāo)記分子只有在加入刺激因子LIF后才開始表達,細胞極性標(biāo)記分子的表達標(biāo)志著腎小球的形成(圖4)[27-29]。綜上所述,本課題組成功分離了后腎間充質(zhì)細胞,證實了LIF能誘導(dǎo)小鼠后腎間充質(zhì)細胞分化為腎小囊和腎小管上皮細胞,LIF誘導(dǎo)細胞分化過程中伴隨細胞極性標(biāo)記分子基因的高表達,本研究為闡明腎臟發(fā)生發(fā)育的分子機制及慢性腎臟疾病的細胞治療法提供了理論依據(jù)。

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