(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院血管外科,湖南衡陽(yáng)421001)

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis obliterans,ASO)是嚴(yán)重威脅人類生命以及影響病人生活質(zhì)量的動(dòng)脈性疾病,其主要臨床癥狀表現(xiàn)為間歇性跛行、明顯疼痛和缺血性肢體潰瘍等。目前治療下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的方法有很多,如球囊擴(kuò)張術(shù)、支架植入術(shù)、旁路手術(shù)等方法,但ASO的遠(yuǎn)期效果卻欠佳,主要原因是手術(shù)后血管的再狹窄(restenosis,RS)。文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道,旁路血管再狹窄其遠(yuǎn)期發(fā)生率可高達(dá)40%,球囊擴(kuò)張對(duì)于狹窄性病變的3年通暢率為61%,閉塞性病變的3年通暢率為48%[3];因此,降低血管再狹窄的發(fā)生率、提高血管遠(yuǎn)期通暢率,改善病人生活質(zhì)量是每位血管外科醫(yī)生面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題。再狹窄的發(fā)生機(jī)理是血管外科領(lǐng)域研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn),目前普遍認(rèn)為其發(fā)生與血栓的形成、炎癥、平滑肌細(xì)胞遷移增殖、基質(zhì)沉著和血管的重塑關(guān)系密切,其中血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移增殖導(dǎo)致內(nèi)膜增厚是再狹窄的主要病理改變[4]。何首烏水溶性成分2,3,4′,5-四羥基二苯乙烯-2-O-B-D葡糖苷(簡(jiǎn)稱二苯乙烯苷,2,3,4′,5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)是何首烏的主要藥效成分,藥理作用十分廣泛,可通過(guò)改善脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集和血管平滑肌細(xì)胞增殖等途徑而達(dá)到防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用[5];但對(duì)于血管狹窄的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在利用大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型,觀察二苯乙烯苷(TSG)對(duì)損傷后血管內(nèi)膜增生及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)表達(dá)的影響,探究其作用機(jī)制,以期為臨床防治血管再狹窄的藥物研發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供。二苯乙烯苷由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供。2.0F Fogarty球囊導(dǎo)管購(gòu)自美國(guó)Boston Scientific公司。免疫組化試劑盒和ERK抗體購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 動(dòng)物分組及頸總動(dòng)脈損傷模型制備

參照Lindner等[6]方法,通過(guò)2.0F Fogarty球囊導(dǎo)管擴(kuò)張制造大鼠頸總動(dòng)脈損傷模型。54只體重350～400 g,10～12周齡的雄性SD大鼠被隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組、手術(shù)組和TSG組,每組18只。假手術(shù)組僅做手術(shù)分離頸動(dòng)脈;而手術(shù)組和TSG組球囊拉傷頸動(dòng)脈;TSG組術(shù)前1周開始每天120 mg/kg灌胃,1次/天,給藥容量為每100 g大鼠1 mL,直至術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn);同時(shí)手術(shù)組和假手術(shù)組用生理鹽水灌胃,容量和次數(shù)均和TSG組相同。普通飼料喂養(yǎng),飲水不限。分別于術(shù)后第7天、14天和21天取出左頸總動(dòng)脈標(biāo)本。

1.3 標(biāo)本處理

在大鼠術(shù)后第7天、14天、21天,每組各取6只大鼠,腹腔注射300 mg/kg、濃度為10%的水合氯醛麻醉,迅速取左側(cè)頸總動(dòng)脈,用4%多聚甲醛溶液固定12 h,經(jīng)常規(guī)梯度乙醇溶液脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,以5 μm厚度切片,然后分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.4 HE染色及圖像分析

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟及復(fù)水后行HE染色。在光鏡下觀察血管內(nèi)膜增生情況,利用計(jì)算機(jī)圖像Image-Pro Plus 6.0軟件分析血管內(nèi)膜(intimal)和中膜(membrane)橫斷面的面積,計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比(I/M),以內(nèi)彈力膜區(qū)別內(nèi)膜和中膜,測(cè)量采用單盲法,測(cè)量者為與本實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)者。

1.5 免疫組化法測(cè)定細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)

一抗小鼠抗大鼠ERK多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供。石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水,加入過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,浸入枸櫞酸鹽緩沖液,用微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù),加封閉液封閉,加一抗p-ERK1/2(#4377,購(gòu)自Cell signaling公司)孵育,用PBS沖洗,加二抗(#sc-2004,購(gòu)自Santa Cruz公司)孵育,再用PBS沖洗,以3、3p二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木精復(fù)染。在光鏡(400倍)下觀察細(xì)胞胞核或胞漿黃染的陽(yáng)性細(xì)胞及血管內(nèi)膜增生情況。

1.6 Western Blot檢測(cè)ERK

每個(gè)血管組織樣本中加入預(yù)冷RIPA裂解緩沖液,冰上勻漿離心后吸取上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度;各組取等量蛋白提取液于沸水浴中加熱5 min,自然冷卻后加入上樣緩沖液在100 V恒壓條件下,經(jīng)10%的SDS-PAGE膠電泳分離,電泳結(jié)束后,把凝膠電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h,再與抗ERK抗體(1:500)4℃反應(yīng)過(guò)夜。室溫條件下TBST震蕩洗膜共3次,再用HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1:5 000)室溫反應(yīng)2 h,PVDF膜TBST充分洗滌3次后應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,暗室內(nèi)壓片、顯影、定影。置于 AlphaImager2200灰度掃描軟件進(jìn)行密度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用±s來(lái)表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用One-way分析對(duì)均數(shù)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 二苯乙烯苷延緩血管損傷后內(nèi)膜增生

分別在術(shù)后第7天、14天和21天,光鏡下觀察頸總動(dòng)脈的病理形態(tài)學(xué)改變(圖1),假手術(shù)組術(shù)后第7天、14天和21天未見(jiàn)新生內(nèi)膜形成,未見(jiàn)管腔狹窄;手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)損傷部位血管均見(jiàn)大量新生內(nèi)膜形成,內(nèi)膜明顯增厚,血管管腔狹窄,血管壁明顯增厚,血管平滑肌細(xì)胞排列穩(wěn)亂,并且14天時(shí)血管內(nèi)膜增厚達(dá)到高峰,14天后內(nèi)膜可繼續(xù)增厚;TSG組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血管內(nèi)膜增厚和血管管腔狹窄等均較手術(shù)組顯著減輕。說(shuō)明二苯乙烯苷可以抑制血管損傷后內(nèi)膜增生(表1)。

圖1 術(shù)后第7天、14天和21天各組血管病理形態(tài)學(xué)改變(HE,×400)

表1 二苯乙烯苷延緩血管損傷后內(nèi)膜增生(內(nèi)膜中膜面積比)

2.2 二苯乙烯苷對(duì)損傷血管壁pERK1/2表達(dá)的影響

pERK1/2主要表達(dá)于胞漿中,其陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色。圖2結(jié)果顯示：在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn),假手術(shù)組均未見(jiàn)pERK1/2表達(dá)增高(P＜0.05);手術(shù)組術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血管損傷部位pERK1/2表達(dá)均明顯增高(P＜0.05);而TSG組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血管損傷部位pERK1/2表達(dá)均明顯低于手術(shù)組(P＜0.05)(表2)。

圖2 術(shù)后第7天、14天和21天各組血管pERK1/2的表達(dá)(SABC法,×400)

2.3 二苯乙烯苷對(duì)損傷血管壁pERK1/2表達(dá)的影響

分別在術(shù)后第7天、14天和21天,用Western Blot測(cè)定損傷部位血管組織中pERK1/2的表達(dá)(圖3)。圖像分析結(jié)果顯示：手術(shù)組術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血管損傷部位pERK1/2蛋白表達(dá)量均明顯高于假手術(shù);而TSG組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血管損傷部位pERK1/2表達(dá)均明顯低于手術(shù)組。

3 討 論

血管術(shù)后再狹窄的防治已成為研究熱點(diǎn),手術(shù)過(guò)程中不可避免地出現(xiàn)內(nèi)皮的損傷和剝脫,而內(nèi)皮損傷是再狹窄發(fā)生的始動(dòng)因素,在由損傷刺激所激活的多種轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等共同作用下,血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscle cell,VSMC)表型發(fā)生轉(zhuǎn)化向內(nèi)膜下遷移增殖,并進(jìn)一步分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì),從而形成新生內(nèi)膜,導(dǎo)致管腔狹窄[7-8],其中血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移增殖導(dǎo)致內(nèi)膜增厚是再狹窄的主要病理表現(xiàn)[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明如果抑制新生內(nèi)膜形成,可以預(yù)防再狹窄[9-10]。

VSMCs的增殖受多種生長(zhǎng)刺激因子和抑制因子的雙重調(diào)節(jié),在VSMCs的增殖過(guò)程中這些因子通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路彼此間形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[11-12]。其中,有絲分裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinases,MAPK)在此病理生理過(guò)程起著重要的作用[13],而在MAPK家族中參與增殖最主要的成員是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK),ERK包括ERK1和ERK2兩種異構(gòu)體(分子量分別為p44和p42)。這兩種異構(gòu)體具有相似的激活動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞定位和底物,在大多數(shù)情況下它們的功能相似。Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路的主要途徑[14];當(dāng)血管損傷后,多種生長(zhǎng)因子持續(xù)激活Ras蛋白,活化的Ras作為銜接蛋白與Raf結(jié)合,將Raf從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜[15]。進(jìn)而激活 MEK,使ERK磷酸化而活化,再通過(guò)磷酸化下游底物分子進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,使血管平滑肌增生遷移至內(nèi)膜,再次大量增殖并合成分泌細(xì)胞外基質(zhì),從而導(dǎo)致內(nèi)膜增生狹窄[16]。ERK 1/2激活后,能激活下游轉(zhuǎn)錄因子如 Jun、Fos等,進(jìn)而誘導(dǎo) cyclinD的表達(dá),促使CDK4和CDK6形成復(fù)合體,使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。有研究表明,在球囊損傷血管后,用不同的方法檢測(cè)ERK1/2的表達(dá),可以檢測(cè)到ERK1/2的活性升高[17]。本實(shí)驗(yàn)在球囊損傷血管后第7天、14天和21天分別用免疫組織化學(xué)染色方法和蛋白免疫印跡法檢測(cè)損傷血管組織中ERK1/2的表達(dá),得到了同樣的發(fā)現(xiàn),手術(shù)組ERK1/2的表達(dá)明顯增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 WesternBlot檢測(cè)術(shù)后第7天(A)、14天(B)、21天(C)血管中pERK1/2的表達(dá)(n=3)

何首烏為蓼科植物,何首烏提取的最重要的有效成分是二苯乙烯苷(TSG),它是一種白色粉末,易溶于水。因此本實(shí)驗(yàn)利用二苯乙烯苷良好的水溶性,每天按TSG給藥劑量為120 mg/kg、給藥容量為生理鹽水1 mL/100 g大鼠給予灌胃。張偉等[18]分別用30、60、120 mg/kg TSG對(duì)As模型SD大鼠灌胃處理,發(fā)現(xiàn)120 mg/kg TSG組抑制炎癥反應(yīng)及保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞方面最為顯著。

在體外實(shí)驗(yàn)抑制血管平滑肌細(xì)胞方面,許曉樂(lè)等[19]研究顯示,在血清刺激下G0/G1期的細(xì)胞明顯減少,進(jìn)入S期、G2/M期的細(xì)胞增多,表明細(xì)胞增殖活躍。用TSG處理組與10%FBS組相比,G0/G1期比例明顯增高,S期細(xì)胞減少。上述研究提示二苯乙烯苷抑制VSMCs增殖可能是阻止了VSMCs通過(guò)細(xì)胞周期中的G1/S限制點(diǎn),使其不能進(jìn)入S期來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Chen等[20]研究顯示,TSG可抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growthfactor,PDGF)誘導(dǎo)的小牛血管平滑肌細(xì)胞增殖。而TSG抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面相對(duì)較少,且能否抑制血管損傷后內(nèi)膜的增生?本實(shí)驗(yàn)在術(shù)后第7天、14天和21天分別取假手術(shù)組、手術(shù)組、TSG組左頸總動(dòng)脈標(biāo)本進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)TSG組血管損傷部位內(nèi)膜增殖及管壁增厚,管腔縮小均明顯低于手術(shù)組,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這一結(jié)果說(shuō)明了TSG能夠抑制血管損傷后內(nèi)膜的增生。那么這一結(jié)果是否又和ERK1/2有關(guān)呢?本實(shí)驗(yàn)在術(shù)后第7天、14天和第21天用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)各組血管ERK1/2的表達(dá),結(jié)果顯示：TSG組pERK1/2的表達(dá)均明顯低于手術(shù)組,這一結(jié)果提示二苯乙烯苷抑制血管損傷后內(nèi)膜增生的機(jī)制可能與抑制ERK活化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)再用Western Blot方法檢測(cè)各組血管中pERK1/2蛋白的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了其抑制作用可能與ERK的活化有關(guān)。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)研究,提示二苯乙烯苷可以延緩血管損傷后內(nèi)膜增生,并且其機(jī)制可能與抑制ERK活化有關(guān)。

二苯乙烯苷作為傳統(tǒng)中醫(yī)藥,具有十分廣泛藥理作用,且價(jià)格低廉,隨著研究的深入,其在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、血管內(nèi)膜增厚中的作用將有著較廣泛的前景,可能會(huì)發(fā)展成為一種新型的治療藥物。

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