(南華大學醫(yī)學院病原生物學研究所,湖南衡陽421001)

日本血吸蟲病(Schistosomiasis)是一種呈世界性分布、嚴重危害人類健康的人獸共患病,傳播廣泛,危害嚴重,至今仍然是世界上亟待解決的嚴重的公共衛(wèi)生問題。人和動物等終宿主對人體血吸蟲無先天性免疫,但是宿主感染血吸蟲后對再感染可產(chǎn)生不同程度的抵抗力,而對再感染具有一定免疫力被稱為伴隨免疫(concomitant immunity)。伴隨免疫是部分免疫,對血吸蟲再感染的殺傷作用有限,并不能完全清除宿主體內(nèi)蟲體,如果未進行有效的治療,血吸蟲對宿主的損害會持續(xù)存在。目前,雖然吡喹酮等有效藥物在治療血吸蟲病方面有很好的效果,但對血吸蟲傳播的控制仍存在許多問題,再感染需要再治療,花費巨大,且反復治療后血吸蟲產(chǎn)生耐藥性的可能性也不容忽視。組織蛋白酶B(cathepsin B,CB)屬于半胱氨酸酶,對血吸蟲組織蛋白酶B的研究顯示其具有下列作用：直接破壞宿主紅細胞,將宿主紅細胞中的血紅蛋白降解加以利用[1],促進蟲體的生長發(fā)育及雌蟲產(chǎn)卵[2];具有侵襲力,破壞宿主的物理屏障[3],有利于蟲體在宿主組織內(nèi)移行[4-6]。2004年本文課題組首次分離出Sjcb2(Schistosoma japonicum cathepsin B2,Sjcb2),并對其誘導BALB/c小鼠產(chǎn)生保護性免疫作用進行了初步研究,結果顯示其具有一定的抗血吸蟲感染作用,本文進一步研究了其在抗血吸蟲再感染中的作用以及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNA3.1(+)質(zhì)粒由本實驗室保存;pBCsk+/Sjcb2(帶有Sjcb2 cDNA全長的克隆重組質(zhì)粒)由本室制備保存(基因登錄號AY226984)。4～5周齡BALB/c雌性小鼠,由南華大學實驗動物中心提供。辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG和抗鼠IgE抗體購自Promega公司,EcoRI、XhoⅠ酶購自Promega公司,質(zhì)粒大量提取試劑盒購自廣州東盛有限公司。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸引物的設計及合成 根據(jù)Genbank中日本血吸蟲Sjcb2基因(序列號AY226984)全序列設計1對引物P1和P2,并在2個引物的5′端分別引入限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)酶切位點(引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。

1.2.2 pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒構建 用Sjcb2特異性引物P1、P2對目的基因進行PCR擴增及產(chǎn)物純化,用EcoRⅠ和XhoⅠ分別對Sjcb2基因片段和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進行雙酶切,分別回收和純化目的基因與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒,按基因克隆方法進行連接和轉化,篩選重組質(zhì)粒,用PCR和雙酶切法初步鑒定,經(jīng)基因測序進一步確認。

1.2.3 質(zhì)粒的大量制備 按照質(zhì)粒大量提取試劑盒操作說明,大量制備pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒,蛋白核酸定量儀測定DNA純度及含量,用生理鹽水稀釋至1 μg/μL。

1.2.4 動物分組與免疫 將60只BALB/c雌性小鼠隨機均分為六組,建立日本血吸蟲感染動物模型：感染組、感染攻擊組、空質(zhì)粒處理組、Sjcb2免疫組、吡喹酮處理組(PZQ處理組)、Sjcb2聯(lián)合吡喹酮處理組(Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組)。Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合吡喹酮組分別在初次尾蚴感染前第21天、14天及7天接種pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒,空質(zhì)粒處理組接種pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒。初次尾蚴感染后第六周,對吡喹酮處理組和Sjcb2聯(lián)合吡喹酮處理組小鼠給予PZQ治療。除感染組外其它各組在第八周再次進行尾蚴攻擊感染。分別于第8周和第14周各組處死5只小鼠,收集成蟲、肝臟組織和血清等標本待檢測備用。

1.2.5 檢測小鼠荷蟲數(shù)和計算抗血吸蟲再感染率用生理鹽水經(jīng)門靜脈灌注,收集成蟲并計數(shù)。分別計數(shù)初次感染和再次感染后血吸蟲成蟲數(shù)。

1.2.6 抗血吸蟲再感染率的計算 R%=[1-(n1-n2)/N]×100%?！癛”為抗血吸蟲再感染率,“n1”為再次感染后血吸蟲成蟲數(shù),“n2”為初次感染后血吸蟲成蟲數(shù),“N”為感染對照組血吸蟲成蟲數(shù)。1.2.7 蟲卵肉芽腫直徑的測量 第14周行麻醉后處死小鼠,取小鼠肝臟左葉組織,經(jīng)10%甲醛固定,進行石蠟包埋,制作5 μm厚的切片,HE染色,光鏡下選單個蟲卵肉芽腫測量最大直徑,以30個單卵肉芽腫直徑的均值(±s)表示。

1.2.8 血清抗體水平的檢測 可溶性成蟲抗原稀釋至10 μg/mL,4℃包被過夜,ELISA法檢測特異性抗體水平。

1.2.9 可溶性成蟲抗原(SWA)的制備 采用門靜脈灌注法,從重感染45天的家兔肝門靜脈沖出血吸蟲成蟲,用生理鹽水漂洗3次,然后加適量生理鹽水于勻漿器中冰浴勻漿1 h,反復凍融3～5次,4℃中冷浸72 h,4℃10 000 rpm離心30 min,取上清液即為成蟲抗原。在核酸蛋白分析儀上對SWA進行蛋白定量,蛋白含量為1.390 6 mg/mL,分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析通過SPSS17.0軟件進行分析,兩兩比較采用t檢驗,所得數(shù)據(jù)以±s表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 目的基因片段的體外擴增

采用PCR法特異性擴增Sjcb2基因片段,該片段分子量約為1 100 bp,與預期目的片段大小相符(圖1)。

圖1 Sjcb2基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 1：PCR產(chǎn)物;2：陽性對照 3：DNA Markers

2.2 pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定

PCR產(chǎn)物與重組質(zhì)粒EcoRI和XhoⅠ雙酶切后的片段約1 100 bp與Sjcb2基因片段大小相符,測序證實序列正確(圖2)。

圖2 pcDNA3.1(+)/Sjcb2雙酶切及PCR鑒定 1：DNA Makers;2：重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)/Sjcb2;3：pcDNA3.1(+)/Sjcb2 EcoRI和XhoI雙酶切;4：PCR產(chǎn)物

2.3 小鼠荷蟲數(shù)和抗血吸蟲再感染率

Sjcb2免疫組、PZQ處理組及Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與其它組比較,血吸蟲尾蚴再次感染后的小鼠荷蟲數(shù)均存在顯著差異(P＜0.01)。Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它組比較,抗血吸蟲再感染率顯著性增高(P＜0.01)。在六組中Sjcb2免疫組抗血吸蟲再感染率為最高(表1)。

表1 小鼠荷蟲數(shù)和抗血吸蟲再感染率

2.4 蟲卵肉芽腫直徑的測量

研究結果表明,與感染攻擊組相比,Sjcb2免疫組、PZQ處理組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組蟲卵肉芽腫直徑都顯著性減小,而其中Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組蟲卵肉芽腫直徑減小最明顯(表2)。

表2 蟲卵肉芽腫直徑測量

2.5 14周小鼠肝臟病變檢測

Sjcb2免疫組、PZQ處理組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與感染攻擊組相比,小鼠肝臟蟲卵肉芽腫直徑都明顯的減小,而其中Sjcb2聯(lián)合PZQ組蟲卵肉芽腫直徑減小最明顯(圖3)。

2.6 血清抗體水平檢測

IgG亞型(IgG1,IgG2和IgG3)以及IgE檢測結果顯示,Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它組比較,IgG1水平顯著性下降,IgG2水平顯著性升高(P＜0.05),見表3。

Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與其它組比較,抗血吸蟲成蟲可溶性抗原(soluble adult worm antigen,SWA)特異性IgE水平顯著性升高(P＜0.01)。Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與其它組比較,抗Sjcb2特異性IgE水平顯著性增加(P＜0.01)。見圖4。

圖3 小鼠肝臟蟲卵肉芽腫HE染色圖(×40)

表3 血清抗體水平的檢測

圖4 血清特異性IgE水平

3 討 論

宿主感染血吸蟲后原發(fā)感染繼續(xù)存在,而對再感染產(chǎn)生不同程度的抵抗力,即伴隨免疫(concomitant immunity),這已在國內(nèi)外的許多研究中得到證實[7-8]。在本實驗中Sjcb2組、PZQ處理組及Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與其它組比較,血吸蟲尾蚴再次感染后的小鼠荷蟲數(shù)均顯著性減少。PZQ處理組荷蟲數(shù)降低是由于PZQ殺死小鼠體內(nèi)初次感染后的成蟲所致;日本血吸蟲組織蛋白酶B2是本研究小組首次發(fā)現(xiàn)與報道的新基因,基因登陸號為AY225315。Sjcb2定位于血吸蟲腸道,可直接破壞宿主紅細胞,將宿主紅細胞中的血紅蛋白降解加以利用,促進蟲體的生長發(fā)育及雌蟲產(chǎn)卵,同時又能刺激機體產(chǎn)生較強免疫應答。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)：用Sjcb2構建的核酸疫苗具有免疫保護作用,能在一定程度上阻斷血吸蟲的發(fā)育及產(chǎn)卵[9]。Sjcb2免疫組荷蟲數(shù)降低證實了Sjcb2能刺激機體產(chǎn)生保護性免疫作用,對初次和再次感染的血吸蟲有一定抗感染作用;Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組荷蟲數(shù)顯著性下降,可能是聯(lián)合處理方法中PZQ殺死小鼠體內(nèi)初次感染后的成蟲,而Sjcb2具有免疫保護和抗再感染作用,兩者聯(lián)合進一步降低小鼠體內(nèi)的荷蟲數(shù)。

實驗結果顯示：Sjcb2免疫組抗血吸蟲再感染率達70.3%,Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組抗再感染率達61.9%。Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它組比較,抗血吸蟲再感染率顯著性增高。研究表明了Sjcb2能刺激機體產(chǎn)生保護性免疫,具有抗血吸蟲再感染的能力,使得小鼠抗血吸蟲再感染率顯著性增高。Sjcb2免疫組與Sjcb2聯(lián)合組比較,Sjcb2組抗血吸蟲再感染率顯著性增高,Sjcb2聯(lián)合組由于經(jīng)過吡喹酮治療后,殺死了小鼠體內(nèi)首次感染的血吸蟲,導致小鼠伴隨免疫不能建立,小鼠抵抗血吸蟲再感染的能力反而下降;而Sjcb2免疫組初次感染血吸蟲后,經(jīng)再次感染可刺激機體產(chǎn)生伴隨免疫,Sjcb2抗血吸蟲作用和伴隨免疫共同作用使得小鼠抗血吸蟲再感染能力增強。

Sjcb2免疫組、PZQ處理組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它各組比較,小鼠肝臟蟲卵肉芽腫直徑顯著性減小,其中Sjcb2聯(lián)合組蟲卵肉芽腫直徑減小具有極顯著性差異,可能與Sjcb2誘導的保護性免疫反應及抗蟲卵發(fā)育作用有關,使得蟲卵和血吸蟲毛蚴更容易遭受宿主的免疫攻擊,而PZQ有殺蟲作用,減少了蟲卵的產(chǎn)生,二者聯(lián)合能顯著性減少血吸蟲蟲卵引起的免疫病理性反應。

機體體液免疫在抗血吸蟲感染中也發(fā)揮著重要作用,抗體可通過ADCC和調(diào)理作用產(chǎn)生抗蟲作用,在抗血吸蟲感染中所涉及的抗體主要有IgG[10]和IgE。Hagan[11]在研究中發(fā)現(xiàn),成蟲抗原特異性IgE抗體在抗血吸蟲再感染時起重要的作用。IgE不僅在血吸蟲入侵機體后最初24 h誘導效應細胞及效應分子上起關鍵作用,而且在針對血吸蟲獲得性免疫的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。在本實驗中,Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合處理組與其它組比較,抗SWA特異性IgE和抗Sjcb2特異性IgE水平顯著性升高,說明了特異性IgE具有抗血吸蟲再感染作用,本實驗結果與其他學者的相關報道相符。

Dunne[13]研究表明血吸蟲抗原特異性IgG4抗體水平升高,可使得人體更容易受到血吸蟲的再感染,而人類的IgG4亞型和小鼠的IgG1亞型作用是一致的[14]?？寡x再感染的程度受到IgE的保護,而 IgG4(鼠IgG1)的作用卻相反,當?shù)退降腎gE與高水平的IgG4(鼠IgG1)相差100倍以上時,人體更容易受到血吸蟲的再感染。因此,認為可將IgG4(鼠IgG1)和IgE兩者結合起來,評價它們對血吸蟲再感染的抵抗力,根據(jù)IgG4(鼠IgG1)和IgE間的平衡情況來預測機體抗血吸蟲再感染的能力[15]。研究發(fā)現(xiàn)Sjcb2具有降解某些IgG,降低IgG抗體水平的作用[9]。本研究結果顯示,Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它組比較,IgG1亞型水平顯著性下降,IgE水平顯著性升高,可能與Sjcb2刺激機體產(chǎn)生特異性IgE和選擇性降解IgG的作用有關。同時,實驗結果顯示上述兩組小鼠IgG2亞型水平顯著性升高,IgG2亞型在血吸蟲再感染中起何種作用,是否在抗血吸蟲再感染中與IgG1亞型起協(xié)調(diào)作用,目前國內(nèi)外未見相關報道,其作用機制尚不清楚。

綜上所述,血吸蟲組織蛋白酶B2可以促進小鼠IgE水平升高和IgG1水平降低,小鼠抗血吸蟲再感染能力增強,使得血吸蟲再感染時侵襲能力下降。吡喹酮雖能殺死血吸蟲,減少小鼠體內(nèi)的荷蟲數(shù)和蟲卵肉芽腫,但無抗再感染的作用。Sjcb2聯(lián)合PZQ在抗血吸蟲再感染率方面僅低于Sjcb2,而顯著性高于其它各組,且在減少小鼠體內(nèi)荷蟲數(shù)、蟲卵肉芽腫及肝臟免疫病理反應等方面顯著性優(yōu)于Sjcb2和其它組,兩者聯(lián)合在抗血吸蟲病方面具有一定的優(yōu)勢作用,這為防治血吸蟲病提供了一個新的思路。

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